マメ科植物プロテアーゼによる根粒窒素固定の制御

本年度は、窒素固定に異常をきたすミヤコグサsym102変異体の原因遺伝子がコードするプロテアーゼの細胞内局在の解析を試みた。シロイヌナズナのオルソログに関する先行研究、および細胞内局在予測プログラムを用いた解析から、sym102がコードするプロテアーゼはミトコンドリアに局在すると考えられた。そこで、まずミヤコグサの根においてミトコンドリアを可視化するために、MitoTrackerによる染色を実施した。しかしながら、ミヤコグサの根全体において、ミトコンドリアのみをうまく染色することができなかった。次にGFP等との融合タンパク質を用いて、sym102の細胞内局在を解析した。sym102のC末端にGFPを連結した遺伝子を過剰発現プロモーター（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター）で発現するコンストラクトを作製した。同時に、ミトコンドリアに局在することが知られているシロイヌナズナのF1-ATPase γ-subunitのシグナルペプチドの下流にRFPを連結したコンストラクトを構築した。構築した2つのコンストラクトを毛状根形質転換により、野生型のミヤコグサの根で発現させた。その結果、sym102-GFPおよびF1-ATPase γ-subunit-RFPはともに明確なミトコンドリア局在を示した。同様の実験をsym102変異体でも実施したが、ミトコンドリアへの局在およびシグナルの分布の程度は野生型の場合と同様であった。

本年度は、窒素固定に異常をきたすミヤコグサsym102変異体の原因遺伝子がコードするプロテアーゼの細胞内局在の解析を試みた。シロイヌナズナのオルソログに関する先行研究、および細胞内局在予測プログラムを用いた解析から、sym102がコードするプロテアーゼはミトコンドリアに局在すると考えられた。そこで、まずミヤコグサの根においてミトコンドリアを可視化するために、MitoTrackerによる染色を実施した。しかしながら、ミヤコグサの根全体において、ミトコンドリアのみをうまく染色することができなかった。次にGFP等との融合タンパク質を用いて、sym102の細胞内局在を解析した。sym102のC末端にGFPを連結した遺伝子を過剰発現プロモーター（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター）で発現するコンストラクトを作製した。同時に、ミトコンドリアに局在することが知られているシロイヌナズナのF1-ATPase γ-subunitのシグナルペプチドの下流にRFPを連結したコンストラクトを構築した。構築した2つのコンストラクトを毛状根形質転換により、野生型のミヤコグサの根で発現させた。その結果、sym102-GFPおよびF1-ATPase γ-subunit-RFPはともに明確なミトコンドリア局在を示した。同様の実験をsym102変異体でも実施したが、ミトコンドリアへの局在およびシグナルの分布の程度は野生型の場合と同様であった。