Screening of microbial amide-bond forming enzyme for stabilization and functionalization of bioactive fatty acids

用于稳定和功能化生物活性脂肪酸的微生物酰胺键形成酶的筛选

• 批准号: 21K05340
• 负责人: 原 良太郎
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05340/
• 关键词: 脂肪酸アミド; アミド化合物; 脂質メディエーター; 酵素法; アミド結合; 酵素精製; serine protease; Mycobacterium; 酵素; 探索; スクリーニング; 物質生産; 高度不飽和脂肪酸; アミド化; 微生物酵素; バイオ生産

脂肪酸のカルボキシ基にアミンを付加した脂肪酸アミドは、可塑剤として利用されているだけでなく、新たな脂質メディエーターとしての利用が期待される有用化合物である。酵素や微生物を活用したバイオプロセスにより脂肪酸アミドを生産することが可能となれば、化学合成法に依存した現行の製法の代替となり得る。本研究では、多様な脂肪酸のカルボキシ基にアミン類を付加した脂肪酸アミドを生産するための微生物探索と、バイオプロセスへの応用を目指している。今年度は、昨年度見出した脂肪酸アミド生産菌からの酵素精製ならびに遺伝子クローニングを実施した。まず、スクリーニングにより取得したMycobacterium sp. AKU 2014に由来する脂肪酸アミド合成酵素を特定するために、酵素精製を行った。AKU 2014株の無細胞抽出液から4段階のカラムクロマトグラフィーにより部分精製酵素を取得した。精製度は595倍、回収率は0.21 %であり、分子量はSDS-PAGE上で約41,000であった。目的酵素活性と連動するバンドをSDS-PAGEゲルから切り出して、アミノ酸配列を解析したところ、19残基まで配列を取得した。相同性検索の結果、当該酵素のN-末端アミノ酸配列は、データベース上のセリンプロテアーゼと類似性を示した。次に、同定した酵素の組換え大腸菌における発現を試みた。データベースの情報をもとに、目的酵素をコードする遺伝子をPCRにより増幅し、発現用プラスミドに連結した。当該プラスミドを大腸菌に導入し、発現試験を行った。SDS-PAEG分析の結果、目的酵素が可溶性画分に発現していることが確認できた。また、酵素活性を確認したところ、オレイン酸からオレアミド、エルカ酸からエルカミドを合成する活性を認めた。このことから、AKU 2014株のセリンプロテアーゼ様酵素は、脂肪酸アミドの合成活性を有することが判明した。

Fatty acids の カ ル ボ キ シ base に ア ミ ン を plus し た fatty acids ア ミ ド は, plastic tonic と し て using さ れ て い る だ け で な く, new た な lipid メ デ ィ エ ー タ ー と し て の using が expect さ れ る useful compounds で あ る. Enzyme や microbial を use し た バ イ オ プ ロ セ ス に よ り fatty acids ア ミ ド を production す る こ と が may と な れ ば, chemical synthesis に dependent し た の の know-how to replace current と な り る. This study で は, many others な fatty acids の カ ル ボ キ シ base に ア ミ ン class を plus し た fatty acids ア ミ ド を production す る た め の microbial exploration と, バ イ オ プ ロ セ ス へ の 応 with を refers し て い る. Our は ", last year saw a し た fatty acids ア ミ ド producing bacteria か ら の enzyme refined な ら び に heritage 伝 son ク ロ ー ニ ン グ を be applied し た. ま ず, ス ク リ ー ニ ン グ に よ り obtain し た Mycobacterium sp. 2014 に AKU origin す る fatty acids ア ミ ド synthetic enzyme を specific す る た め に, enzyme refined を っ た. The <s:1> cell-free extract of AKU 2014 strain ら ら 4-stage <s:1> カラム <s:1> ロ ロ た トグラフィ トグラフィ によ によ た た and some refined enzymes を obtained た. The fine system is <s:1> 595 times, the return rate is <s:1> 0.21% であ であ, and the molecular weight is で approximately 41,000であった on SDS-PAGE. Purpose と す muscle enzyme activity る バ ン ド を sds-page ゲ ル か ら り cutting out し て, ア ミ ノ acid with column を parsing し た と こ ろ, 19 residues ま で match column を obtain し た. Identity 検 cable の results, when the enzyme is の N - terminal ア ミ ノ acid with は, デ ー タ ベ ー ス on の セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ と similarity を shown し た. This time, に and the same set of た enzyme groups were changed to え coliform bacteria における for を test みた. デ ー タ ベ ー ス の intelligence を も と に purpose and enzyme を コ ー ド す る posthumous son 伝 を PCR に よ り raised し, 発 current プ ラ ス ミ ド に link し た. When the プラス, ドを, escherichia coli に is introduced into ドを, an experiment is conducted on を and った. The results of SDS-PAEG analysis <s:1> showed that the が soluble partition of the target enzyme に showed that <s:1> て る る とが とが とが とが confirmed that で た た た た とが とが とが とが とが ま た, enzyme activity を confirm し た と こ ろ, オ レ イ ン acid か ら オ レ ア ミ ド, エ ル カ acid か ら エ ル カ ミ ド を synthetic す を る activity recognition め た. こ の こ と か ら 2014 strains, AKU の セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ は others in enzyme, fatty acid ア ミ ド の synthetic activity を す る こ と が.at し た.