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Basic research on advanced utilization of squid by elucidating the properties of muscular protein, paramyosin

阐明肌肉蛋白、副肌球蛋白的特性，进行鱿鱼先进利用的基础研究

基本信息

批准号：
21K05429
负责人：
福島英登
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度作製した、アカイカおよびアメリカオオアカイカのパラミオシン発現用大腸菌を用いて、リコンビナント・パラミオシン(rPm)の発現および精製条件を検討した。初めに発現用大腸菌をLB液体培地37℃で約2時間かけ対数増殖期まで振盪培養した。その後、①終濃度500μMのIPTGを添加し37℃で3h誘導、②終濃度500μMのIPTGを添加し25℃で24h誘導、③終濃度50μMのIPTGMを添加し20℃で96h誘導の3条件で発現誘導した。誘導後集菌した菌体を高イオン強度緩衝液中で超音波破砕し、遠心分離によりrPmを含む上清を得た。低イオンおよび高イオン強度緩衝液に対する透析と再溶解後に遠心分離に供しrPmを精製した。各精製工程で標品を採取し、SDS-PAGEによりrPmの精製度合いを確認した。この他に、SDS-PAGEによりイカ筋肉由来のパラミオシンとrPmを比較した。また、タンパク質比色定量であるBCA法によりタンパク質収量を調べた。SDS-PAGEから①の条件では、rPmの発現は確認できたが、菌体破砕後、上清中にごく少量しか確認できなかった。すなわちこの条件では封入体が形成されrPmを回収することが困難であった。②および③の条件でもrPmの発現が確認できたが、③の菌体の方がrPmの発現量が多かった。以上の結果、本研究で構築したrPm発現系は、IPTG濃度を終濃度50μMに抑え、20℃の低温で96hという長時間の誘導が封入体の形成抑制に効果的であり、効率よくrPmを発現することが分かった。③の発現誘導後のタンパク質収量は800mlのLB液体培地に対して、アカイカrPmは12.1mg、アメリカオオアカイカrPmは16.2mgであった。今後は本手法で調製したrPmを用いて、動的粘弾性測定装置を用いた加熱ゲル形成過程の解析に取り組む。

In the previous year, we made a survey of the current use of large bacteria in the previous year. (rPm) was used in the first year. At present, the liquid culture of LB was used in primary culture, and the culture temperature was about 2 hours at 37 ℃. The culture time was about 2 hours. After 1 °C 500 μ M IPTG, add 37 ℃ for 3 h, 2 °500 μ M for IPTG, 25 ℃ for 24 h, 3 °50 μ M for IPTGM, and 20 ℃ for 96 h. The supernatant of the supernatant was contained in the liquid of high strength of bacteria, ultrasonic wave, heart separation, rPm and so on. Low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low temperature, low temperature, high strength, high strength, low temperature, low temperature, high strength, low strength, high strength, low temperature, high strength The quality of each engineering standard is selected, and the accuracy of SDS-PAGE is in line with that of rPm. Let's talk about him, SDS-PAGE him, let him know where the muscle comes from, and let him know that he's got a lot of rPm. Colorimetric quantitative analysis, BCA method, quantitative colorimetric method, quantitative colorimetric method. After SDS-PAGE and rPm conditions, a small amount of DNA in the supernatant was confirmed after cell breakage. This is the first time that the sealing body has formed a rPm. Condition 2, condition 3, condition rPm, confirm that the amount of bacteria is high, and that the amount of bacteria in the rPm is very high. The above results showed that in this study, the temperature of rPm was tested, the temperature of IPTG was 50 μ M, the temperature of 20 ℃ and the temperature of 96 h led to the formation of an inhibitory effect on fruit, and the rate of rPm was used to detect the fractionation of fruit. 3. Now that you can see, you will need to measure the liquid 800ml, rPm, 12.1mg, rPm, 16.2mg, etc. In the future, this method will be used to determine the viscosity of the rPm system and the process analysis system.