Study of DNA damage and repair mechanism in porcine embryos obtained from vitrified oocytes and zygotes, and its relevance to genome editing

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卵母細胞ならびに胚のRad51 免疫染色を試みたが、現在、効率的な抗体が入手・利用できないため、信頼できる結果は得られなかった（供給業者は、以前は品質の高い抗体の生産・販売を行っていたが中止した）。したがって、Rad51の計測は、遺伝子発現の結果(RT-qPCR) として呈示する。その後、以下に示す研究プロジェクトの次の段階に移行した。エレクトロポレーションを介したCRISPRcas9を使用してOCT4 またはCD46 遺伝子またはその両方をノックアウトすることにより、体外成熟/受精によって作製し、ガラス化/加温したブタ受精卵にゲノム編集を適用した。各実験区で、ゲノム編集による胚盤胞への発生を確認した。 さらに、ブタ接合体のガラス化保存後、OCT4/CD46ダブルノックアウトして、胚盤胞を作ることに成功した。低温保存されたブタ受精卵からのゲノム編集胚の作製の初めての成功例である。ガラス化またはゲノム編集単独では、胚盤胞の生産率は低下しなかった。しかし、それらの組み合わせは胚盤胞への発生を低減させた。それでも、ゲノム編集後に胚盤胞まで発育したガラス化接合体の割合は20％以上でした。ゲノム編集された胚盤胞は小さく見える。また、遺伝子配列の確認により、受精卵のガラス化は、得られた胚盤胞におけるゲノム編集の効率を低下させないことが明らかとなった。現時点では、胚盤胞率の低下が、変異導によるものか、ガラス化保存およびエレクトロポレーションによるストレスの蓄積によるものかは明らかではない。