Study of DNA damage and repair mechanism in porcine embryos obtained from vitrified oocytes and zygotes, and its relevance to genome editing

玻璃化卵母细胞和受精卵猪胚胎DNA损伤和修复机制及其与基因组编辑的相关性研究

基本信息

批准号：
21K05912
负责人：
ソムファイタマス
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

卵母細胞ならびに胚のRad51 免疫染色を試みたが、現在、効率的な抗体が入手・利用できないため、信頼できる結果は得られなかった（供給業者は、以前は品質の高い抗体の生産・販売を行っていたが中止した）。したがって、Rad51の計測は、遺伝子発現の結果(RT-qPCR) として呈示する。その後、以下に示す研究プロジェクトの次の段階に移行した。エレクトロポレーションを介したCRISPRcas9を使用してOCT4 またはCD46 遺伝子またはその両方をノックアウトすることにより、体外成熟/受精によって作製し、ガラス化/加温したブタ受精卵にゲノム編集を適用した。各実験区で、ゲノム編集による胚盤胞への発生を確認した。さらに、ブタ接合体のガラス化保存後、OCT4/CD46ダブルノックアウトして、胚盤胞を作ることに成功した。低温保存されたブタ受精卵からのゲノム編集胚の作製の初めての成功例である。ガラス化またはゲノム編集単独では、胚盤胞の生産率は低下しなかった。しかし、それらの組み合わせは胚盤胞への発生を低減させた。それでも、ゲノム編集後に胚盤胞まで発育したガラス化接合体の割合は20％以上でした。ゲノム編集された胚盤胞は小さく見える。また、遺伝子配列の確認により、受精卵のガラス化は、得られた胚盤胞におけるゲノム編集の効率を低下させないことが明らかとなった。現時点では、胚盤胞率の低下が、変異導によるものか、ガラス化保存およびエレクトロポレーションによるストレスの蓄積によるものかは明らかではない。

我们尝试了RAD51卵母细胞和胚胎的免疫染色，但是由于目前尚无高效抗体或可用的有效抗体（供应商以前停止生产和销售高质量抗体），因此无法获得可靠的结果。因此，由于基因表达（RT-QPCR），提出了RAD51测量值。然后将研究项目移至下一阶段：将基因组编辑应用于玻璃/温暖的猪施肥鸡蛋，这些卵是通过在玻璃化/温暖的情况下通过电覆盖而通过电穿孔击倒CRISPRCAS9而产生的。在每个实验区中，基因组编辑用于确认胚泡的发育。此外，在猪结合物的玻璃化和存储后，将OCT4/CD46击倒，并成功地产生了胚泡。这是从冷冻保存的猪施肥鸡蛋中创建基因组编辑的胚胎的第一个成功例子。玻璃化或基因组编辑并不能减少胚泡的产生。但是，它们的组合减少了胚泡的发育。尽管如此，基因组编辑后发展为胚泡的玻璃化结合物的比例仍超过20％。基因组编辑的胚泡看起来很小。此外，对基因序列的确认表明，受精卵的玻璃化不会降低所获得的胚泡中基因组编辑的效率。目前，尚不清楚胚泡速率的降低是由于突变诱导还是由于玻璃化和电穿孔而导致的应力积累。