低毒性ガラス化保存液による哺乳動物胚の超急速凍結

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1.耐凍剤の毒性試験:細胞透過性耐凍剤であるエチレングリコール (C) 、グリセロール (GL) 、プロピレングリコール (PG) を30、40あるい50%含む、PBIまたは0.5M-蔗糖添加PBI、およひ非透過性高分子とし10%ボリエチレングリコール (PEG) 、30%Ficollあるいは50%prcollを含むFBIにマウス桑実胚を浮遊させ、20℃に20および60分間保存した。透過性耐凍剤に保存した胚は0.5M-蔗糖添加各保存液、0.5M-蔗糖添加PBI、PBIに各5分間保存後に、また非透過性高分子区では直接PBIに移して耐凍剤を徐去したのちに、mkRB液で培養して拡大胚盤胞への発育率を調べた。PBIで希釈した透過性耐凍剤で20分間保存した胚は、30%EC、30%GLおよび40%EG区で高率に発育した。蔗糖添加PBSで希釈した場合には生存性は延長された。非透過性高分子の毒性はいずれも低かった。2.溶液のガラス化試験:EG、GLおよびPGが30、40、50%になるように、PBIまたは非透過性高分子添加PBIで調製し、0.25mlストローに封入後直接液体窒素に浸して凍結したのち、20℃水中で急速融解した。液体窒素中および融解中に、保存液を観察し、氷晶形成の有無を調べた。EGあるいはGLを50%含む多くの区、およびEGあるいはGLを30%Ficolldを添加PBIで希釈した40%区において、氷晶形成がみられなかった。3.胚のガラス化試験:低毒性で、凍結融解時に氷晶形成しない溶液として、30%Ficoll+0.5M-蔗糖添加PBIでEGを40%に希釈した液を選び、20℃でマウス胚を5分間浮遊させてガラス化保存した。20℃で融解-耐凍剤除去後、体外培養して生存性を調べた結果、高率に発育した。C3H系雄マウスと交配させたJCR系雌マウスより採取した胚を同様にガラス化保存後、偽妊娠雌マウスに移植した結果、生存産子が得られた。4.上記3と同液で家兎桑実胚をがらす化保存したのち家兎血清を含むmkRB液で体外培養した結果、対照区に近い割合で胚盤胞に発育した。