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カルシウムポンプの調節メカニズムの構造学的解明

钙泵调节机制的结构阐明

基本信息

批准号：
21K06062
负责人：
椛島佳樹
金额：
$ 2.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では心筋における調節ペプチドであるphospholamban（PLN）による筋小胞体Ca2+ポンプの活性調節メカニズムの理解を目的としている。令和4年度は、前年度に引き続き、①COS細胞-アデノウイルス蛋白質発現系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の大量生産系の構築、②クライオ電顕を用いた原子構造決定のための試料作製条件の最適化を行うとともに、新たに、③浮遊293細胞-BacMamウイルス蛋白質発現系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の大量生産系の構築を行った。①前年度までに作成した20個のGly残基から成るリンカーによりSERCAとPLNを遺伝子工学的に連結した融合蛋白質の発現用コンストラクトを用いてアデノウイルスを作製した。さらに、疑似燐酸化変異を導入した融合蛋白質（S16E変異体）の発現用アデノウイルスも作製し、これらのウイルスをCOS7細胞に感染させ小スケールの発現チェックを行った。その結果、構造解析に十分な量の発現が観察されたため、ウイルスの大量調製を行い、高力価のアデノウイルスを得た。②クライオ電顕を用いた単粒子解析による構造決定を目指し、ウサギ骨格筋より精製したSERCAのナノディスク化条件を検討した。膜骨格蛋白質としてはMSP1D1を用いて界面活性剤の種類、界面活性剤の除去方法（時間、温度など）、ゲルろ過条件などを検討し、電顕観察に適したナノディスク化及び観察用グリッド作製条件を最適化することができた。③浮遊293細胞-BacMamウイルス系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の発現系構築を検討した。融合蛋白質の遺伝子を導入したバクミドを作製し、ウイルス調製条件を検討したところ高力価のウイルスを作製することに成功した。蛋白質発現時の培地の種類や添加剤などを検討することにより、クライオ電顕解析に適用可能な量のタンパク質を得ることができた。

The aim of this study is to understand the regulation of Ca2 + in the cytosome of the muscle cells by phospholamban (PLN). In 2004 and 2005, we introduced the following: (1) Construction of SERCA-PLN fusion protein mass production system using COS cell-BacMart protein development system;(2) Optimization of sample preparation conditions using atomic structure determination; and (3) Construction of SERCA-PLN fusion protein mass production system using 293 cell-BacMart protein development system. In the previous year, 20 Gly residues were created and linked to the development of fusion proteins. The fusion protein (S16E variant), which is suspected to be phosphorylated, was introduced into COS 7 cells and used to infect COS7 cells. The results, structural analysis, and the discovery of a large number of modulation and high power components were obtained. 2. To determine the structure of a single particle in the electric field, to determine the conditions for refining SERCA. The type of surfactant, the method of removing the surfactant (time, temperature), the process conditions, the electric field conditions and the optimization of the process conditions for the membrane protein MSP1D1 are discussed. (3) Construction of SERCA-PLN fusion protein development system using floating 293 cell-BacMart system The fusion protein gene was successfully introduced into the system and the modulation conditions were discussed. Protein development in the culture of the type of additives, such as: