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Functional characterization of novel P-type ATPAses potentially associated with lysosomal proteolysis

可能与溶酶体蛋白水解相关的新型 P 型 ATPA 酶的功能表征

基本信息

批准号：
21K06090
负责人：
羽鳥勇太
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Yasuda Women's University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2021年度・2022年度を通じて、組換えアデノウイルスを用いたP5-ATPaseの発現系の構築を進め、酵素活性の保持と高収量を達成した。2021年度は局在解析を中心として実験を実施し、共焦点顕微鏡下でライブセルイメージングによりオルガネラ動態とATP13A2（およびATP13A3）分子の挙動の比較解析を行った。その結果、ATP13A2分子の発現によりミトコンドリア外膜タンパク質であるTom20が、ミトコンドリアからオートファジー経路へとリクルートされるとの新たな発見が得られた。2022年度には、Tom20を始めとしたミトコンドリアタンパク質との相互作用の検討を進め、その成果をPLOS One誌に発表した（PLoS One. 17, e0276823, 2022）。2022年度の成果として、ATP13A2を大量発現して得られた膜画分を用い、ATPase活性を指標として新規の輸送基質の探索を進めた。その結果、これまでに特定されているポリアミン類（スペルミン、スペルミジン、プトレッシン）に加え、複数のモノアミンまたはその前駆体でもATPase活性が惹起されるとの新たな知見を見出した。組換えアデノウイルスの利点を活かし、リポフェクション法では高効率の遺伝子導入が困難な細胞株でも大量発現を試み、SH-SY5Y（ヒト神経芽種由来）からATP13A2含有膜画分を単離することに成功した。現在、神経芽腫由来の膜画分を用い、モノアミン類とその前駆体を中心に、輸送基質の特定を進めている。この新しい成果の一部は、日本薬学会第143年会にて発表済であり、さらに詳細なデータを収集した後、年度内に学術論文として報告する予定である。

In 2021 and 2022, P5-ATPase production system construction, enzyme activity maintenance and high yield were achieved through the development, transformation and utilization of P5-ATPase. In 2021, the analysis center was implemented, and the confocal microscope was used to analyze the molecular dynamics of ATP13A2 (ATP13A3). As a result, ATP13A2 molecule was discovered in the outer membrane of the cell. In 2022, Tom20 began to discuss the interaction between nature and nature, and the results of PLOS One were announced (PLoS One. 17, e0276823, 2022）。The results of 2022 show that ATP13A2 has been found in large quantities, and the application of ATPase activity index and new transport matrix have been explored. As a result, new insights were found into the activity of ATPase in the precursor of the enzyme. In order to improve the efficiency of gene transfer, SH-SY5Y (source of gene) and ATP13A2-containing membrane separation were successfully used in cell lines with high gene transfer efficiency. At present, the origin of neuroblastoma membrane separation, the use of different types of precursors, the transport of specific matrix into the process The first part of this new work is scheduled to be presented at the 143rd Annual Meeting of the Japanese Academy of Sciences.