ゲノムを創り、細胞に導入する方法；合成ゲノム活用に向けて

令和4年度は、昨年度までの成果を受けて出芽酵母と枯草菌それぞれを用いたGap Repair Cloning (GRC) 法を実施した。ヒトゲノムやラムダファージゲノムなどを用いてゲノム構築を実践した結果、いくつか問題点を見出すことができた。まず出芽酵母を用いた場合は、コピー数が少ないので出芽酵母からの直接的な精製が困難なため、大量精製のために大腸菌に導入し直して精製するのが一般的であるが、いろいろなゲノム配列の構築を進めていくうちに、大腸菌での大量調整が困難な配列があることが判明した。これは酵母では問題ないものの、大腸菌細胞中では、遺伝子が発現してしまい、大腸菌の生育を阻害してしまうためではないかと考えられる。その結果著しい大腸菌の生育遅延または変異が生じてしまう。さらに出芽酵母の高い組換え効率の影響で酵母自体の細胞中でも継体培養を続けるうちに、変異及び欠失などが起こることも判明した。これにより酵母のGRC法直後のコロニーPCRでは、確認できていたゲノム配列を安定に維持し、精製できない場合が見られた。一方枯草菌でのGRC法では、最大7断片、サイズとしては40kbまでのゲノム構築が可能になってきたが、それ以上のサイズについては今のところ成功に至ってない。今年度は、これらの問題点が明らかとなったことで今後打開策に向けた研究も検討した。さらに細胞導入法の開発に関しては、枯草菌を溶菌して出芽酵母だけでなく、溶菌液を用いてエレクトロポレーションによりピキア酵母へも導入できることを実証した。さらに出芽酵母を溶菌して枯草菌へ導入できるかなどの実験も試みた。接合伝達に関しては、広域宿主に接合伝達可能な大腸菌用の接合伝達プラスミドpUB307を用いて、大腸菌から出芽酵母、ピキア酵母及び水素酸化細菌への接合伝達が可能であることを確認した。

令和4年度は、昨年度までの成果を受けて出芽酵母と枯草菌それぞれを用いたGap Repair Cloning (GRC) 法を実施した。ヒトゲノムやラムダファージゲノムなどを用いてゲノム構築を実践した結果、いくつか問題点を見出すことができた。まず出芽酵母を用いた場合は、コピー数が少ないので出芽酵母からの直接的な精製が困難なため、大量精製のために大腸菌に導入し直して精製するのが一般的であるが、いろいろなゲノム配列の構築を進めていくうちに、大腸菌での大量調整が困難な配列があることが判明した。これは酵母では問題ないものの、大腸菌細胞中では、遺伝子が発現してしまい、大腸菌の生育を阻害してしまうためではないかと考えられる。その結果著しい大腸菌の生育遅延または変異が生じてしまう。さらに出芽酵母の高い組換え効率の影響で酵母自体の細胞中でも継体培養を続けるうちに、変異及び欠失などが起こることも判明した。これにより酵母のGRC法直後のコロニーPCRでは、確認できていたゲノム配列を安定に維持し、精製できない場合が見られた。一方枯草菌でのGRC法では、最大7断片、サイズとしては40kbまでのゲノム構築が可能になってきたが、それ以上のサイズについては今のところ成功に至ってない。今年度は、これらの問題点が明らかとなったことで今後打開策に向けた研究も検討した。さらに細胞導入法の開発に関しては、枯草菌を溶菌して出芽酵母だけでなく、溶菌液を用いてエレクトロポレーションによりピキア酵母へも導入できることを実証した。さらに出芽酵母を溶菌して枯草菌へ導入できるかなどの実験も試みた。接合伝達に関しては、広域宿主に接合伝達可能な大腸菌用の接合伝達プラスミドpUB307を用いて、大腸菌から出芽酵母、ピキア酵母及び水素酸化細菌への接合伝達が可能であることを確認した。