遺伝子ホーミング・エンドヌクレアーゼと長鎖DNAとの複合体の構造生物学研究

基因归巢核酸内切酶与长链DNA复合物的结构生物学研究

• 批准号: 13033005
• 负责人: 佐藤 能雅
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033005/
• 关键词: 遺伝子ホーミング; エンドヌクレアーゼ; 二本鎖DNA; X線結晶構造解析; 構造生物学; DNA複合体; 酵素複合体; スプライシング; DNA2本鎖

酵母のVMA1遺伝子がコードするVMA1蛋白質からプロテインスプライシングで生ずるエンドヌクレアーゼVDEは,自らのVDE遺伝子を欠くVMA1ΔVDEを認識して切断し,VDE遺伝子を挿入する遺伝子ホーミングを引き起こす。本研究では,VDEが認識する長鎖の二本鎖DNAとVDEとの複合体のX線結晶構造解析を行い,DNAの認識とエンドヌクレアーゼによる切断反応の機構を明らかにし,遺伝子ホーミング現象の構造生物学的な理解を得ることを目的とした。研究の2年度では,回折能が良好な,19塩基長と31塩基長のDNA鎖から成る二本鎖DNAとVDEの複合体の結晶について,シンクロトロン放射光を用いてX線回折強度データを収集し,複合体の全体構造を結晶学的な最小二乗法により精密化した。結晶構造では,VDEと二本鎖DNAは各々1分子づつで複合体を形成していること,DNAは19塩基対長に渡って二本鎖を形成し,VDEのドメインIとドメインIIIの広い分子表面の領域で接触していることが判明した。DNA切断部位はVDEのドメインIにあり,このエンドヌクレアーゼ活性部位では,用いたDNAは一本鎖となっていること,さらに,酵素の活性部位はAspやLysなどの活性残基のセットが2組が対になっていることなど,二本鎖DNAの認識と切断に関する詳細な三次元構造知見を得ることができた。VDEを生ずるプロテインスプライシング反応とエンドヌクレアーゼ活性の関係を調べるため,スプライシング反応の進行を遅くした変異体を種々発現させ,精製,結晶化し,そのうちの2種類の構造をX線解析により明らかにした。その結果,スプライシング反応の初期ステップ,反応とエンドヌクレアーゼ活性のサイトは異なる領域であることを明らかにできた。また,黄色ブドウ球菌カセットリコンビナーゼ2種の発現,精製と結晶化を研究では行った。

The VMA1 gene of yeast is called VMA1 protein, and VDE gene is called VMA1 ΔVDE gene. This study aims to understand the structure of DNA and VDE complexes by X-ray crystallography, and to understand the mechanism of DNA and VDE in structural biology. In the past two years, the reflection energy of the complex was very good. The structure of the complex was refined by the least squares method of crystallography. The crystal structure of VDE and DNA is composed of 1 molecule and 1 molecule. The structure of DNA is composed of 2 molecules and 1 molecule. The structure of VDE and DNA is composed of 1 molecule and 1 molecule. The structure of VDE and DNA is composed of 1 molecule and 1 molecule. The structure of VDE and DNA is composed of 1 molecule and 1 molecule. DNA cleavage site is VDE and active site is active site is VDE and active site is active site is Asp and active site is Asp and active site is active site is active site. VDE production process, such as the production of high-quality products, the production of high-quality products. As a result, the initial stage of the reaction was reversed, and the reaction was reversed. Two species of yellow cocci were discovered, refined and crystallized.

项目成果

S.Miyamoto, R.Mizutani, Y.Satow: "Crystallographic Studies on Yeast Homing Endonuclease VDE in Comlex with Double-Stranded DNA Substrates"SPring-8 Experiment Report. 9. 204 (2002)

S.Miyamoto、R.Mizutani、Y.Satow：“双链 DNA 底物 Comlex 中酵母归巢核酸内切酶 VDE 的晶体学研究”SPring-8 实验报告。

R.Mizutani, T.Tsuchida, H.Yuzawa, T.Ito, K.Hiramatsu, Y.Satow: "Expression, Purification, and DNA-Binding Assay of a Staphylococcal Cassette Chromosome Recombinase CcrA"The 6^<th> Interncational Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections. 99

R.Mizutani、T.Tsuchida、H.Yuzawa、T.Ito、K.Hiramatsu、Y.Satow：“葡萄球菌盒染色体重组酶 CcrA 的表达、纯化和 DNA 结合测定”第 6 届国际研讨会

Ken Murase, Ryuta Mizutani, Yoshinori Satow: "Expression, characterization and crystallization of the Fv fragment of mouse antibody 3B62 from the secondary immune response"Acta Crystallographica. D57. 1703-1705 (2001)

Ken Murase、Ryuta Mizutani、Yoshinori Satow：“来自二次免疫反应的小鼠抗体 3B62 Fv 片段的表达、表征和结晶”《晶体学报》。

Ryuta Mizutani, Shunsuke Miyamoto, Yoshinori Satow: "Mechanism of catalytic reaction by yeast VMA1 endonuclease"SPring-8 Experiment Report. 7. 154-154 (2001)

Ryuta Mizutani、Shunsuke Miyamoto、Yoshinori Satow：“酵母VMA1核酸内切酶催化反应的机制”SPring-8实验报告。

R.Mizutani, S.Nogami, M.Kawasaki, Y.Ohya, Y.Anraku, Y.Satow: "Crystal Structure of Spliceable Precursors of Yeast VMA1-Derived Homing Endonuclease"Acta Crystallographica. A58S. C108 (2002)

R.Mizutani、S.Nogami、M.Kawasaki、Y.Ohya、Y.Anraku、Y.Satow：“酵母 VMA1 衍生的归巢核酸内切酶的可剪接前体的晶体结构”晶体学报。