微生物新薬開発を実現するTarget-AIDゲノム編集法による全ゲノム解析の確立

利用Target-AID基因组编辑方法建立全基因组分析，实现微生物新药开发

• 批准号: 21K06136
• 负责人: 坂野 聡美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06136/
• 关键词: ゲノム編集; 大腸菌; 遺伝子工学; CRISPR; 薬剤耐性

本研究は、自然突然変異を模した形で変異導入が可能なゲノム編集ツールTaget-AIDを用いた、ゲノムワイドスクリーニング法を確立し、その結果得られた微生物の生存システム等を詳細に解析することを目的とする。現在のところ、大腸菌の標的1遺伝子内には、ある程度効率よい変異導入が実現されている。そこで、本課題１年目では、このTarget-AIDを用いた薬剤耐性菌の変異個所探索の予備的実験を行った。CRISPR-gRNAを導入した大腸菌に薬剤選択圧をかけ、表現型に関わる新たな変異個所を探索することができるかどうか、条件検討を行った。rifampicin耐性関連遺伝子rpoB、fluoroquinolone耐性関連遺伝子gyrAを選定し、MIC assayにより各薬剤の最適濃度を決定した。次に、標的配列20塩基をランダムに設計してプラスミド型CRISPR-gRNAを構築し、大腸菌に導入した。各薬剤の選択圧下における大腸菌を集菌し、プラスミド抽出後、gRNA部分を次世代シーケンサーで配列解読した。その結果、rifampicin耐性大腸菌からはrpoB以外の特異配列、nalidixic acid耐性大腸菌からはgyrA以外の特異配列が、それぞれ複数同定された。これらは大腸菌ゲノム上に100%マッチはせず、類似配列が推定されるのみであった。次に、プラスミド抽出した大腸菌の全ゲノム配列の解読を試みたところ、機知の関連遺伝子以外の変異箇所を複数同定した。そのうちのいくつかは、先述の特異配列に依存した変異導入であることが確認された。しかし、その配列を含めて再構築したCRISPR-gRNAを再び大腸菌に導入したが、薬剤耐性を獲得することはできなかった。

The results of this study were analyzed in detail. Now, the target of Escherichia coli is introduced into the gene to a different extent. In the first year of this project, we carried out the research on the application of Target-AID to resistant bacteria. CRISPR-gRNA is introduced into E. coli, and the expression of CRISPR-gRNA is related to the discovery of new genes. The rifampicin resistance-related gene rpoB and fluoroquinolone resistance-related gene gyrA were selected, and the MIC assay was used to determine the optimal concentration of each agent. Next, the target sequence 20 gene was designed to construct a novel CRISPR-gRNA and introduce it into E. coli. The E. coli was isolated from the cells under the selected conditions, and the gRNA was isolated from the cells in the next generation. Results: rifampicin-resistant E. coli with specific alignment other than rpoB, nalidixic-acid-resistant E. coli with specific alignment other than gyrA, rifampicin-resistant E. coli with multiple alignmentこれらは大肠菌ゲノム上に100%マッチはせず、类似配列が推定されるのみであった。In addition, the total number of E. coli strains isolated from the genome is determined by the number of different genes other than the gene. This is the first time that we have seen such a thing. CRISPR-gRNA was introduced into E. coli and the resistance was acquired.