微生物新薬開発を実現するTarget-AIDゲノム編集法による全ゲノム解析の確立

利用Target-AID基因组编辑方法建立全基因组分析，实现微生物新药开发

基本信息

批准号：
21K06136
负责人：
坂野聡美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06136/
关键词：
ゲノム編集大腸菌遺伝子工学 CRISPR 薬剤耐性

项目摘要

本研究は、自然突然変異を模した形で変異導入が可能なゲノム編集ツールTaget-AIDを用いた、ゲノムワイドスクリーニング法を確立し、その結果得られた微生物の生存システム等を詳細に解析することを目的とする。現在のところ、大腸菌の標的1遺伝子内には、ある程度効率よい変異導入が実現されている。そこで、本課題１年目では、このTarget-AIDを用いた薬剤耐性菌の変異個所探索の予備的実験を行った。CRISPR-gRNAを導入した大腸菌に薬剤選択圧をかけ、表現型に関わる新たな変異個所を探索することができるかどうか、条件検討を行った。rifampicin耐性関連遺伝子rpoB、fluoroquinolone耐性関連遺伝子gyrAを選定し、MIC assayにより各薬剤の最適濃度を決定した。次に、標的配列20塩基をランダムに設計してプラスミド型CRISPR-gRNAを構築し、大腸菌に導入した。各薬剤の選択圧下における大腸菌を集菌し、プラスミド抽出後、gRNA部分を次世代シーケンサーで配列解読した。その結果、rifampicin耐性大腸菌からはrpoB以外の特異配列、nalidixic acid耐性大腸菌からはgyrA以外の特異配列が、それぞれ複数同定された。これらは大腸菌ゲノム上に100%マッチはせず、類似配列が推定されるのみであった。次に、プラスミド抽出した大腸菌の全ゲノム配列の解読を試みたところ、機知の関連遺伝子以外の変異箇所を複数同定した。そのうちのいくつかは、先述の特異配列に依存した変異導入であることが確認された。しかし、その配列を含めて再構築したCRISPR-gRNAを再び大腸菌に導入したが、薬剤耐性を獲得することはできなかった。

这项研究旨在使用Taget-Aid建立一种全基因组筛查方法，Taget-Aid是一种基因组编辑工具，允许以模仿自发突变的形式进行诱变，并对所得的生存系统等进行详细的分析。当前，在大肠杆菌的靶基因中以某种有效的方式实现诱变。因此，在这项任务的第一年，我们进行了初步实验，以使用靶标的AID来寻找耐药细菌中的突变。我们研究了是否可以将药物选择压力施加到crispr-grna引入的大肠杆菌，以及是否可以搜索与表型有关的新突变。选择了利福平抗性相关的基因RPOB和氟喹诺酮与抗性相关的基因Gyra，并通过MIC测定确定每个药物的最佳浓度。接下来，随机设计了20个目标序列碱基序列，以构建质粒型CRISPR-GRNA并引入大肠杆菌。在每种药物的选择性压力下收集大肠杆菌，并在质粒提取后，使用下一代序列测序GRNA部分。结果，从抗利福平的大肠杆菌中鉴定出除RPOB以外的多个特定序列，并且从耐纳利尼二酸的大肠杆菌中鉴定出除GYRA以外的几个特定序列。这些在大肠杆菌基因组上不匹配100％，并且仅推导类似的序列。接下来，当试图破译已用质粒提取的大肠杆菌的整个基因组序列时，除了与机智相关的基因以外，还发现了多个突变。其中一些被确认为诱变，取决于上述特定序列。但是，已通过序列重建的CRISPR-GRNA被重新引入了大肠杆菌，但无法获得耐药性。