微生物の全ゲノム解析を実現する「DNA非切断型」Target-AID技術の拡張

本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うTarget-AID 技術を、次世代の合成生物学、遺伝子工学を飛躍的に発展させる基盤技術として確立することを目的とする。具体的には、塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1 と配列認識モジュールCRISPR-gRNA を原核生物に導入するだけで、複数の標的DNA の同時編集を簡便かつ高確率に行うツールへと技術拡張し、応用・実用化に向けて研究を進めてきた。現在、大腸菌ゲノムの標的1遺伝子内に、ある程度効率よく変異を導入することが可能となっている。しかしながら、複数の標的DNA への同時塩基置換を、簡便化かつ高効率化することが課題である。そこで、本課題３年目では、まず、複数遺伝子への同時塩基置換の効率を上げるために、３～６種類の標的部位をもつCRISPR-gRNAプラスミドを同時に大腸菌に導入する際の培養条件検討と同時塩基置換の効率を調べた。様々な方法を試した結果、３～４遺伝子への同時塩基置換を確認することができたが、その置換効率は配列に依存しており、まったく置換されない配列というのもあった。今後は、プラスミドに頼らない遺伝子編集法の構築を検討する必要がある。次に、技術の拡張に向けて、標的1遺伝子変異導入を用いた、薬剤耐性菌の変異個所探索法の培養条件検討を行った。培養時の薬剤添加とゲノム編集を行うタイミングを試行錯誤した結果、薬剤耐性に関わる既知の遺伝子以外の配列がいくつか同定された。現在その配列情報に関しては解析中である。今後は、培養条件の再検討やスクリーニング法の改良などを行い、Target-AIDを用いた新規遺伝子スクリーニング法の構築を行う予定である。

本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うTarget-AID 技術を、次世代の合成生物学、遺伝子工学を飛躍的に発展させる基盤技術として確立することを目的とする。具体的には、塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1 と配列認識モジュールCRISPR-gRNA を原核生物に導入するだけで、複数の標的DNA の同時編集を簡便かつ高確率に行うツールへと技術拡張し、応用・実用化に向けて研究を進めてきた。現在、大腸菌ゲノムの標的1遺伝子内に、ある程度効率よく変異を導入することが可能となっている。しかしながら、複数の標的DNA への同時塩基置換を、簡便化かつ高効率化することが課題である。そこで、本課題３年目では、まず、複数遺伝子への同時塩基置換の効率を上げるために、３～６種類の標的部位をもつCRISPR-gRNAプラスミドを同時に大腸菌に導入する際の培養条件検討と同時塩基置換の効率を調べた。様々な方法を試した結果、３～４遺伝子への同時塩基置換を確認することができたが、その置換効率は配列に依存しており、まったく置換されない配列というのもあった。今後は、プラスミドに頼らない遺伝子編集法の構築を検討する必要がある。次に、技術の拡張に向けて、標的1遺伝子変異導入を用いた、薬剤耐性菌の変異個所探索法の培養条件検討を行った。培養時の薬剤添加とゲノム編集を行うタイミングを試行錯誤した結果、薬剤耐性に関わる既知の遺伝子以外の配列がいくつか同定された。現在その配列情報に関しては解析中である。今後は、培養条件の再検討やスクリーニング法の改良などを行い、Target-AIDを用いた新規遺伝子スクリーニング法の構築を行う予定である。