細胞接着制御因子Rap1による新たな好中球細胞死制御メカニズムの解明

細胞接着シグナルとNETosisとの関連性を示唆する報告はあるものの、NETosisの詳細な分子メカニズムは未だ不明である。また、定量的なNETosisの評価が難しい現状がある。本研究課題では、当該年度において細胞接着を制御するRap1シグナル分子の好中球特異的ノックアウトマウスの作出を完了し、予定していたノックアウトマウスのバリエーションを揃えることができた。しかし、コロナ禍でのケージ数削減などもあり同時での複数種の比較実験ができていない。いったん数を減らさざるをえなかかったノックアウトマウスの数を再びそろえて比較実験を行う予定である。各種ノックアウトマウスの骨髄由来の好中球を精製してin vitro解析を進めたが、好中球特異的Talin1ノックアウトマウスの骨髄由来細胞ではTalin1のノックアウトが不十分であったため、細胞調整の段階で再検討を要した。骨髄内の未分化好中球ではCreによる遺伝子発現阻害が不十分だと考え、末梢（腹腔）からの好中球回収を進めた。LPS、Zymosan、caseinの腹腔内投与で惹起される好中球浸潤を野生型と好中球特異的Mst1ノックアウトマウスを用いて腹腔内および血中で比較した。新しい回収法によりin vitroの実験に使える細胞数を確保することは可能であるが、必要なマウス数を減らすためには今後は刺激後の経時的なデータを集める必要がある。NETosisの定量的画像評価に関しては再現性や解析方法に課題はあるものの、類似の報告が近年多く報告されており、静止画での解析は学術的新規性が薄れていると判断した。そのため、血管内の血流を模倣した条件下での解析を進めている。最終年度で動画データを用いた機械学習を導入し、MATLABソフトウエアでNETosis形態評価プログラムを進める予定である。

細胞接着シグナルとNETosisとの関連性を示唆する報告はあるものの、NETosisの詳細な分子メカニズムは未だ不明である。また、定量的なNETosisの評価が難しい現状がある。本研究課題では、当該年度において細胞接着を制御するRap1シグナル分子の好中球特異的ノックアウトマウスの作出を完了し、予定していたノックアウトマウスのバリエーションを揃えることができた。しかし、コロナ禍でのケージ数削減などもあり同時での複数種の比較実験ができていない。いったん数を減らさざるをえなかかったノックアウトマウスの数を再びそろえて比較実験を行う予定である。各種ノックアウトマウスの骨髄由来の好中球を精製してin vitro解析を進めたが、好中球特異的Talin1ノックアウトマウスの骨髄由来細胞ではTalin1のノックアウトが不十分であったため、細胞調整の段階で再検討を要した。骨髄内の未分化好中球ではCreによる遺伝子発現阻害が不十分だと考え、末梢（腹腔）からの好中球回収を進めた。LPS、Zymosan、caseinの腹腔内投与で惹起される好中球浸潤を野生型と好中球特異的Mst1ノックアウトマウスを用いて腹腔内および血中で比較した。新しい回収法によりin vitroの実験に使える細胞数を確保することは可能であるが、必要なマウス数を減らすためには今後は刺激後の経時的なデータを集める必要がある。NETosisの定量的画像評価に関しては再現性や解析方法に課題はあるものの、類似の報告が近年多く報告されており、静止画での解析は学術的新規性が薄れていると判断した。そのため、血管内の血流を模倣した条件下での解析を進めている。最終年度で動画データを用いた機械学習を導入し、MATLABソフトウエアでNETosis形態評価プログラムを進める予定である。