発生現象を模倣し四肢復元再生技術の基盤を構築する

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2022年度は（1）ヒト四肢前駆細胞様細胞のトランスクリプトーム解析、（2）トランスジェニック（TG）ニワトリ作出の開始、（3）AER培養系の最適化に重点的に取り組んだ。（1）前年度にヒト側板中胚葉から四肢前駆細胞様細胞を誘導する培養条件を見出したが、誘導された細胞の遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析していなかったため、RNA-Seq解析を実施した。その結果、誘導された細胞では、多くの側板中胚葉マーカー遺伝子の発現が低下していたのに対して、ほぼすべての四肢前駆細胞マーカーの発現が上昇していた。また、マウス内在性四肢前駆細胞と比較したところ、四肢マーカーの発現レベルは両者間でほぼ同等であることが明らかとなった。さらにヒトiLPCリプログラミングについても開始しており、最適化された培養条件にてマウス四肢前駆細胞リプログラミング因子（PZLL）を強制発現すると、四肢前駆細胞マーカー遺伝子の発現上昇がみられることを突き止めている。（2）ニワトリiLPCおよびiAER作製の基盤となる四肢前駆細胞/AER-二重レポーターニワトリの作出に着手した。前年度に作成したコンストラクトを用いて、Prx1-ZsGreen（前駆細胞レポーター）とMsx2-DsRed(AERレポーター)がゲノム内に挿入されたニワトリ始原生殖細胞を樹立した。その始原生殖細胞をニワトリ胚へと移植しF0個体を得た。今秋、F0個体を掛け合わせることで、レポーター遺伝子を持ったニワトリF1胚を入手する予定である。（3）iAERリプログラミング法の確立に取り組む前に、内在性のAER細胞を維持する培養系の条件検討を行なった。様々な条件にてAER細胞を培養したところ、AER細胞をハイドロゲル内に包埋し、GSK3b阻害剤、Fgf10、ROCK阻害剤存在下で培養すると、2週間に渡りAERマーカーの発現が維持されることがわかった。