発生現象を模倣し四肢復元再生技術の基盤を構築する

模仿发育现象为肢体修复再生技术奠定基础

• 批准号: 21K06201
• 负责人: 熱田 勇士
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06201/
• 关键词: 四肢前駆細胞; ダイレクトリプログラミング; AER; 3次元培養; 四肢発生; リプログラミング; 四肢再生

2022年度は（1）ヒト四肢前駆細胞様細胞のトランスクリプトーム解析、（2）トランスジェニック（TG）ニワトリ作出の開始、（3）AER培養系の最適化に重点的に取り組んだ。（1）前年度にヒト側板中胚葉から四肢前駆細胞様細胞を誘導する培養条件を見出したが、誘導された細胞の遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析していなかったため、RNA-Seq解析を実施した。その結果、誘導された細胞では、多くの側板中胚葉マーカー遺伝子の発現が低下していたのに対して、ほぼすべての四肢前駆細胞マーカーの発現が上昇していた。また、マウス内在性四肢前駆細胞と比較したところ、四肢マーカーの発現レベルは両者間でほぼ同等であることが明らかとなった。さらにヒトiLPCリプログラミングについても開始しており、最適化された培養条件にてマウス四肢前駆細胞リプログラミング因子（PZLL）を強制発現すると、四肢前駆細胞マーカー遺伝子の発現上昇がみられることを突き止めている。（2）ニワトリiLPCおよびiAER作製の基盤となる四肢前駆細胞/AER-二重レポーターニワトリの作出に着手した。前年度に作成したコンストラクトを用いて、Prx1-ZsGreen（前駆細胞レポーター）とMsx2-DsRed(AERレポーター)がゲノム内に挿入されたニワトリ始原生殖細胞を樹立した。その始原生殖細胞をニワトリ胚へと移植しF0個体を得た。今秋、F0個体を掛け合わせることで、レポーター遺伝子を持ったニワトリF1胚を入手する予定である。（3）iAERリプログラミング法の確立に取り組む前に、内在性のAER細胞を維持する培養系の条件検討を行なった。様々な条件にてAER細胞を培養したところ、AER細胞をハイドロゲル内に包埋し、GSK3b阻害剤、Fgf10、ROCK阻害剤存在下で培養すると、2週間に渡りAERマーカーの発現が維持されることがわかった。

In 2022, we focused on (1) the analysis of the cell culture profile of the anterior limb cells,(2) the start of the cell culture profile, and (3) the selection of key optimization components for AER culture systems. (1) The culture conditions for induction of embryonic cells in the lateral plates of the previous year were observed and analyzed by RNA-Seq analysis. As a result, the development of embryonic cells in many lateral plates decreased and the development of embryonic cells in four limbs increased. The inner part of the limb is the same as the outer part of the limb In order to optimize the culture conditions, the expression of PZLL (Pro-Limb Cell Growth Factor) was increased and the expression of PZLL increased. (2) ILPC and IAER are the basic mechanisms for the development of AER-2. In the previous year, the original germ cell was established by Prx1-ZsGreen and Msx2-DsRed. The original germ cells were transferred from the embryo to the F0 individual. This autumn, F0 individuals will be linked to the next generation. (3) The conditions for the establishment and maintenance of culture systems for iAER cells were discussed. Under these conditions, AER cells were cultured in the presence of GSK3b inhibitor, FGF10 and ROCK inhibitor, and the development of AER cells was maintained within 2 weeks.

项目成果

In ovo electroporation of chicken limb bud ectoderm

鸡肢芽外胚层卵内电穿孔

• DOI: 10.1002/dvdy.352
• 发表时间: 2021
• 期刊: Developmental Dynamics
• 影响因子: 2.5
• 作者: Tomizawa Reiko R.;Tabin Clifford J.;Atsuta Yuji
• 通讯作者: Atsuta Yuji

Direct Reprogramming of Non-limb Fibroblasts to Cells with Properties of Limb Progenitors

• DOI: 10.1101/2021.10.01.462632
• 发表时间: 2021-10
• 期刊: bioRxiv
• 作者: Y. Atsuta;Changhee Lee;Alan R Rodrigues;Charlotte Colle;Reiko R. Tomizawa;Ernesto Lujan;P. Tschopp;Joshua M. Gorham;J. Vannier;C. Seidman;J. Seidman;O. Pourquié;C. Tabin

Prime editing in chicken fibroblasts and primordial germ cells

• DOI: 10.1111/dgd.12823
• 发表时间: 2022-11-29
• 期刊: DEVELOPMENT GROWTH & DIFFERENTIATION
• 影响因子: 2.5
• 作者: Atsuta, Yuji;Suzuki, Katsuya;Saito, Daisuke
• 通讯作者: Saito, Daisuke