Centrioleの自己複製における鋳型の意義の解明

本研究の到達目標は、微小管の数が正常な9本ではなく6本や7本などの大きく異なる数の中心子を形成するクラミドモナス株を作出し、そこから形成される娘中心子の微小管数を計測し、母中心子の鋳型としての役割を解明することである。そのために、１）母・娘中心子ペアの微小管数を計測する技術と、２）微小管数が異常な中心子を正常な細胞質中で複製させる技術を開発する必要がある。１）については、昨年度は、集束イオンビーム（FIB）加工を用いたSEM観察によって三次元構造の再構成を試みたが、微小管数が判別できるほどの解像度の画像を得ることはできなかった。そこで今年度は、単離した母・娘中心子ペアの微小管を蛍光タキソールで可視化し、それらを膨張顕微鏡法（Expansion microscopy）で観察することを試みた。膨張顕微鏡法は、試料をゲルに包埋して膨張させてから観察する方法で、中心子の微小管数が判別できることが報告されている。現在は単離中心子をゲルに包埋する条件などを検討中である。今後はこの方法で母・娘中心子間の微小管数の相関を検討する予定である。２）については、クラミドモナスの接合現象を利用して、遺伝子操作によって微小管数が異常になった細胞と野生型細胞を融合する方法を検討していた。しかし、細胞融合後に二倍体細胞として増殖する細胞の割合がごくわずかであることが判明し、そのような細胞を追跡することが困難であることが明らかとなった。今後は、細胞周期の同調が容易なクラミドモナス株（C239株）を用い、中心子複製期の細胞質を調製して、中心子のin vitro複製の可能性を探る予定である。

本研究の到達目標は、微小管の数が正常な9本ではなく6本や7本などの大きく異なる数の中心子を形成するクラミドモナス株を作出し、そこから形成される娘中心子の微小管数を計測し、母中心子の鋳型としての役割を解明することである。そのために、１）母・娘中心子ペアの微小管数を計測する技術と、２）微小管数が異常な中心子を正常な細胞質中で複製させる技術を開発する必要がある。１）については、昨年度は、集束イオンビーム（FIB）加工を用いたSEM観察によって三次元構造の再構成を試みたが、微小管数が判別できるほどの解像度の画像を得ることはできなかった。そこで今年度は、単離した母・娘中心子ペアの微小管を蛍光タキソールで可視化し、それらを膨張顕微鏡法（Expansion microscopy）で観察することを試みた。膨張顕微鏡法は、試料をゲルに包埋して膨張させてから観察する方法で、中心子の微小管数が判別できることが報告されている。現在は単離中心子をゲルに包埋する条件などを検討中である。今後はこの方法で母・娘中心子間の微小管数の相関を検討する予定である。２）については、クラミドモナスの接合現象を利用して、遺伝子操作によって微小管数が異常になった細胞と野生型細胞を融合する方法を検討していた。しかし、細胞融合後に二倍体細胞として増殖する細胞の割合がごくわずかであることが判明し、そのような細胞を追跡することが困難であることが明らかとなった。今後は、細胞周期の同調が容易なクラミドモナス株（C239株）を用い、中心子複製期の細胞質を調製して、中心子のin vitro複製の可能性を探る予定である。