好酸球に内在の脂肪酸代謝によるタンパク質修飾の網羅的解析

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本研究では、好酸球に高発現する多価不飽和脂肪酸（PUFA）代謝酵素12/15-LOXの機能解明を目指している。とくに、本酵素により生成する反応性脂質代謝物（lipid-derived electrophile: LDE）が修飾する細胞内タンパク質に着目し、最先端のケミカルプロテオミクス解析技術によってLDEの標的を明らかにするとともに、その機能の解明を目標としている。本年度は、これまでに脂肪酸由来のケミカルプローブ等によって検出した好酸球の脂質修飾タンパク質について、LC-MS/MSを用いたプロテオミクス解析による同定を行った。腹腔細胞から10^7オーダーの好酸球が回収できるIL-5トランスジェニック（Tg）マウスから単離した好酸球に対し、12/15-LOXの阻害剤の処理・未処理の条件下で脂肪酸アルキンプローブを処理し、細胞内タンパク質を修飾させた。その後、クリック反応によって修飾タンパク質にビオチンを付加し、ストレプトアビジンビーズへの吸着、on beadsでのトリプシン消化の後プロテオミクス解析を行った。その結果、全部で813種類のタンパク質が同定された中、12/15-LOXの阻害剤によって有意にシグナルが減弱したタンパク質が144種類認められ、これらが好酸球における12/15-LOX由来LDEによる修飾タンパク質と考えられた。LDEは主にタンパク質のシステイン残基を修飾することが知られている。そこで、システイン反応性のケミカルプローブを用いた濃縮とプロテオミクスと組み合わせることで、好酸球におけるシステイン修飾状態の変動をプロテオームワイドに捉えることも試みた。その結果、脂肪酸アルキンプローブにより見出されたLDEの標的タンパク質における、修飾部位のシステイン残基の候補を得ることに成功した。