好酸球に内在の脂肪酸代謝によるタンパク質修飾の網羅的解析

嗜酸性粒细胞内源性脂肪酸代谢对蛋白质修饰的综合分析

• 批准号: 21K06557
• 负责人: 磯部 洋輔
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06557/
• 关键词: 好酸球; リポキシデーション; 12/15-LOX; ケミカルプロテオミクス; ケミカルバイオロジー; 標的同定

本研究では、好酸球に高発現する多価不飽和脂肪酸（PUFA）代謝酵素12/15-LOXの機能解明を目指している。とくに、本酵素により生成する反応性脂質代謝物（lipid-derived electrophile: LDE）が修飾する細胞内タンパク質に着目し、最先端のケミカルプロテオミクス解析技術によってLDEの標的を明らかにするとともに、その機能の解明を目標としている。本年度は、これまでに脂肪酸由来のケミカルプローブ等によって検出した好酸球の脂質修飾タンパク質について、LC-MS/MSを用いたプロテオミクス解析による同定を行った。腹腔細胞から10^7オーダーの好酸球が回収できるIL-5トランスジェニック（Tg）マウスから単離した好酸球に対し、12/15-LOXの阻害剤の処理・未処理の条件下で脂肪酸アルキンプローブを処理し、細胞内タンパク質を修飾させた。その後、クリック反応によって修飾タンパク質にビオチンを付加し、ストレプトアビジンビーズへの吸着、on beadsでのトリプシン消化の後プロテオミクス解析を行った。その結果、全部で813種類のタンパク質が同定された中、12/15-LOXの阻害剤によって有意にシグナルが減弱したタンパク質が144種類認められ、これらが好酸球における12/15-LOX由来LDEによる修飾タンパク質と考えられた。LDEは主にタンパク質のシステイン残基を修飾することが知られている。そこで、システイン反応性のケミカルプローブを用いた濃縮とプロテオミクスと組み合わせることで、好酸球におけるシステイン修飾状態の変動をプロテオームワイドに捉えることも試みた。その結果、脂肪酸アルキンプローブにより見出されたLDEの標的タンパク質における、修飾部位のシステイン残基の候補を得ることに成功した。

这项研究旨在阐明多不饱和脂肪酸（PUFA）代谢酶的功能12/15-lox，该酶在嗜酸性粒细胞中高度表达。特别是，我们专注于该酶产生的反应性脂质代谢产物（LDE）修饰的细胞内蛋白质，旨在使用尖端的化学蛋白质组学分析技术阐明LDES的靶标并澄清其功能。在今年，使用LC-MS/MS蛋白质组学分析鉴定出使用脂肪酸衍生的化学探针检测到的嗜酸性粒细胞的脂质改性蛋白。从腹膜细胞中恢复10^7个嗜酸性粒细胞的IL-5转基因（TG）小鼠中分离出的嗜酸性粒细胞在未经治疗的条件下用脂肪酸炔烃探针治疗，并在未处理的细胞内蛋白质下用脂肪酸炔烃探针进行处理。随后，通过点击反应，对链霉亲和蛋白珠的吸附，与珠子上的胰蛋白酶消化添加到修饰的蛋白质中，并进行了蛋白质组学分析。结果，在总共813种蛋白质中，发现了144种蛋白质，这些蛋白质通过12/15-lox的抑制剂显着降低了信号，并且这些蛋白质被认为是通过嗜酸性粒细胞中12/15-lox得出的LDE被认为修饰的蛋白质。已知LDE主要改变蛋白质中的半胱氨酸残基。因此，我们还试图通过使用蛋白质组学的半胱氨酸反应化学探针将嗜酸性粒细胞蛋白质组的半胱氨酸修饰状态的变化与蛋白质组蛋白质组的变化。结果，我们在脂肪酸炔烃探针发现的LDE靶蛋白中成功获得了候选半胱氨酸残基。