Identification of physiological substrates of osmotic stress-responsive ubiquitin ligase using genome editing, and its involvement in colitis

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RNF183遺伝子にビオチンリガーゼBioID2とFLAGタグをゲノム編集によってノックインしたマウスを作出した。ノックインしたマウスからRNF183を発現する細胞を単離するため、蛍光タンパク質tdTomatoとBioID2-3×FLAG-RNF183との間をT2A配列でつなぐことで、tdTomatoとBioID2-3×FLAG-RNF183を別々に発現させることにした。ノックインに成功したマウスを得たため、今後の解析のために現在交配中である。RNF183によるNKCC1のユビキチン化部位を同定するため、NKCC1のN末端欠失変異体およびC末端欠失変異体を作製し、ユビキチン化部位の同定を行った。その結果、NKCC1のC末端欠失変異体においてRNF183による分解が阻害されたことから、RNF183がNKCC1のN末端をユビキチン化することが示唆された。さらに、C末端のユビキチン化部位であるリジン残基を変異させた細胞も複数作製した。RNF183の生理的基質を同定するため、RNF183を発現するマウス集合管細胞mIMCD-3に、ポリユビキチン鎖に高い親和性を持つTUBEを安定発現する細胞を樹立した。さらに、この細胞のRNF183をノックアウトした細胞も樹立した。この細胞を用いて、TUBEに結合したタンパク質からRNF183依存的なユビキチン化タンパク質を質量分析により同定することを現在試みている。