経口投与可能な神経細胞特異的カリウム排出促進薬による神経変性予防効果の実証

口服神经元特异性钾排泄促进剂的神经变性预防效果的证明

基本信息

批准号：
21K06723
负责人：
倉本展行
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Setsunan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

マウス胎児大脳皮質由来初代培養神経細胞におけるKCC2発現をPCRで確認した。この細胞に対してKCC2開口薬または阻害薬を曝露したが、非曝露群と比較してMTT還元能は変化しなかった。一方、予期せず、阻害剤VU 0240551を前処置しておくと初代培養神経細胞にNMDA曝露によるミトコンドリア脱分極の程度が減弱し、NMDA曝露に伴う細胞死が、ある程度抑制された。またVU 0240551単独でもミトコンドリアが緩徐に脱分極したが、これはミトコンドリアKチャネル阻害剤で抑えられた。従って現段階では、KCC2阻害剤には神経保護作用があり、それはミトコンドリアがK+緩衝することで実現している可能性が示唆された。前年度までにすすめてきた簡易カリウムイオンセンサーを用いて、培養液や培養細胞の破砕液及び組織破砕液のK+濃度を簡易に測定し、比較検討する方法を当年度でほぼ確立した。この方法では、個々の細胞内のイオン濃度の定量は不可能で有ったが、薬物曝露有無などによるK+濃度の相対的な相違を定義することができることがわかった。この方法を用いて、K+濃度の異なる培地でインキュベートすると、濃度依存的に細胞内K+濃度が変化することが確認できた。一方で、K+チャネル開口薬による検討では細胞内K+濃度の減少が認められず、方法の調整を行っている。長期飼育（6月以上）マウスの脳内のSUR1及びKir6.2発現量の程度をイムノブロット法で比較すると、低分子SUR1が高齢マウスで増加する傾向が認められた。免疫染色法でも海馬領域で高齢マウス側にSUR1の高いシグナルが認められた。これについては現在は繰り返し実験により真偽を確認中である。

PCR证实了源自胎儿小鼠脑皮质的原代培养神经元中的KCC2表达。将细胞暴露于KCC2开瓶器或抑制剂中，但与非暴露组相比，MTT降低能力没有改变。另一方面，出乎意料的是，抑制剂VU 0240551的预处理减弱了由于NMDA暴露于原发性培养的神经元而导致的线粒体去极化程度，并在某种程度上抑制了与NMDA暴露有关的细胞死亡。 VU 0240551也缓慢地去极化线粒体，该线粒体被线粒体K通道抑制剂抑制。因此，在此阶段，有人提出KCC2抑制剂具有神经保护特性，可以通过线粒体的K+缓冲来实现。在当年，我们已经建立了一种简单地测量和比较培养液体，培养的细胞和组织裂解液体的K+浓度，使用简单的钾离子传感器，直到上一年我们建议使用。尽管这种方法无法对单个细胞内的离子浓度进行定量，但发现由于存在或不存在药物暴露等，可以定义K+浓度的相对差异。使用这种方法，确认在不同K+浓度的培养基中孵育以在浓度依赖于浓度的方式中变化，以变化细胞内K+浓度。另一方面，在使用K+通道开启器进行研究时，未观察到细胞内K+浓度的降低，并调整了该方法。当比较使用免疫印迹的长期饲养（超过6个月）小鼠的大脑中SUR1和KiR6.2的表达程度时，观察到小分子SUR1在老年小鼠中增加的趋势。免疫染色在老年小鼠的海马区域还显示出高的SUR1信号。目前正在通过重复实验对此进行验证。