Establishing the type I CRISPR platform for extra chromosome elimination through epigenetic modulation

建立通过表观遗传调控消除额外染色体的 I 型 CRISPR 平台

基本信息

批准号：
21K06835
负责人：
橋詰令太郎
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06835/
关键词：
染色体消去 CRISPR/Cas トリソミー Down症候群 iPS細胞染色体 CRISPR

项目摘要

本課題は、Down症候群などの過剰染色体を有する核型に対し、染色体消去技術の新規開発を試みるものである。我々研究グループは、トリソミー21のiPS細胞を用いたin vitro実験系において、CRISPR/Cas9による21番染色体単一アレルに対する染色体切断が、標的染色体の細胞からの排除を誘導する知見を得た。さらに、切断箇所数と染色体除去率には正の相関があること、非相同末端結合によるDNA切断後修復機構に関与するLIG4遺伝子や、MMEJに与るPOLQの遺伝子ノックダウンが、染色体除去率の上昇に貢献することを見出した。これらは、CRISPR/Cas9等で染色体切断する際、修復不可能となる確率が上昇し、結果、染色体除去率が向上しているものと思われた。細胞周期依存性であるのか否かは、標的とする細胞によっては重要な問題となりうる。しかしながらいずれにせよ、これらCas9による物理的な染色体切断は、予期せぬ染色体の構造変異を含むゲノム改変のリスクを内包している。そこで我々は、単一染色体アレル特異的な方法で、II型CEISPR-CasシステムであるCas9とともにI型CRISPRであるCas3システム等を用いた、ゲノム改変を極力抑えたあるいは行わない方法の開発を目指している。II型CRISPR のCas9が1ヶ所のDNA切断を行うのに対し、I型CRISPRであるCas3は、リール状にDNAをたぐり寄せるかたちでDNA上を移動しつつ、シュレッダーのように約100 kbに及ぶ長鎖DNAを一方向性に分解することを特徴としている。本研究では、CRISPR/Cas9で得られている知見・理解を基盤とし、ゲノム改変リスクを最少化する目的でペリセントロメア領域に対する染色体分解や、標的染色体へのエピゲノム修飾によるゲノム改変フリーの染色体消去をCRISPR/Cas3を含めて試みる。

该问题旨在为具有多余染色体（例如唐氏综合症）的核型开发新的染色体消除技术。我们已经获得了这样的发现，在使用21 IPS细胞的体外实验系统中，CRISPR/CAS9对单个染色体21等位基因的染色体切割诱导细胞中靶染色体的排除。此外，我们发现裂解位点的数量与染色体去除率之间存在正相关，并且在非同源末端键合DNA裂解后与维修机制有关的LIG4基因与MMEJ在MMEJ中的基因敲低的DNA裂解后有助于增加染色体的去除率。这些结果似乎增加了使用CRISPR/CAS9等进行染色体切割时无法修复的可能性，因此，染色体的去除率得到了提高。取决于目标细胞，是否取决于细胞周期。但是，无论如何，这些物理染色体通过CAS9裂解涵盖了基因组改变的风险，包括意外的染色体结构突变。因此，我们旨在开发一种使用单个染色体等位基因特异性方法的方法，该方法使用II型CEISPR-CAS系统CAS9和I型CRISPR CAS3系统等，以最大程度地减少或消除基因组修饰。虽然II型CRISPR中的Cas9削减了一个DNA，但I型CRISPR中的CAS3以类似卷轴的方式在DNA上移动，而分解长链的DNA（大约100 kb）沿一个方向像碎纸机一样。基于CRISPR/CAS9获得的发现和理解，本研究试图通过表观基因组修饰对靶染色体（包括CRISPR/CAS3）的表观基因组修饰（包括CRISPR/cas3）来最大程度地减少基因组修饰的风险，从而使牙周粒区区域的染色体分解和无基因组修饰的无基因组修饰染色体消除。