Establishing the type I CRISPR platform for extra chromosome elimination through epigenetic modulation

本課題は、Down症候群などの過剰染色体を有する核型に対し、染色体消去技術の新規開発を試みるものである。我々研究グループは、トリソミー21のiPS細胞を用いたin vitro実験系において、CRISPR/Cas9による21番染色体単一アレルに対する染色体切断が、標的染色体の細胞からの排除を誘導する知見を得た。さらに、切断箇所数と染色体除去率には正の相関があること、非相同末端結合によるDNA切断後修復機構に関与するLIG4遺伝子や、MMEJに与るPOLQの遺伝子ノックダウンが、染色体除去率の上昇に貢献することを見出した。これらは、CRISPR/Cas9等で染色体切断する際、修復不可能となる確率が上昇し、結果、染色体除去率が向上しているものと思われた。細胞周期依存性であるのか否かは、標的とする細胞によっては重要な問題となりうる。しかしながらいずれにせよ、これらCas9による物理的な染色体切断は、予期せぬ染色体の構造変異を含むゲノム改変のリスクを内包している。そこで我々は、単一染色体アレル特異的な方法で、II型CEISPR-CasシステムであるCas9とともにI型CRISPRであるCas3システム等を用いた、ゲノム改変を極力抑えたあるいは行わない方法の開発を目指している。II型CRISPR のCas9が1ヶ所のDNA切断を行うのに対し、I型CRISPRであるCas3は、リール状にDNAをたぐり寄せるかたちでDNA上を移動しつつ、シュレッダーのように約100 kbに及ぶ長鎖DNAを一方向性に分解することを特徴としている。本研究では、CRISPR/Cas9で得られている知見・理解を基盤とし、ゲノム改変リスクを最少化する目的でペリセントロメア領域に対する染色体分解や、標的染色体へのエピゲノム修飾によるゲノム改変フリーの染色体消去をCRISPR/Cas3を含めて試みる。

本課題は、Down症候群などの過剰染色体を有する核型に対し、染色体消去技術の新規開発を試みるものである。我々研究グループは、トリソミー21のiPS細胞を用いたin vitro実験系において、CRISPR/Cas9による21番染色体単一アレルに対する染色体切断が、標的染色体の細胞からの排除を誘導する知見を得た。さらに、切断箇所数と染色体除去率には正の相関があること、非相同末端結合によるDNA切断後修復機構に関与するLIG4遺伝子や、MMEJに与るPOLQの遺伝子ノックダウンが、染色体除去率の上昇に貢献することを見出した。これらは、CRISPR/Cas9等で染色体切断する際、修復不可能となる確率が上昇し、結果、染色体除去率が向上しているものと思われた。細胞周期依存性であるのか否かは、標的とする細胞によっては重要な問題となりうる。しかしながらいずれにせよ、これらCas9による物理的な染色体切断は、予期せぬ染色体の構造変異を含むゲノム改変のリスクを内包している。そこで我々は、単一染色体アレル特異的な方法で、II型CEISPR-CasシステムであるCas9とともにI型CRISPRであるCas3システム等を用いた、ゲノム改変を極力抑えたあるいは行わない方法の開発を目指している。II型CRISPR のCas9が1ヶ所のDNA切断を行うのに対し、I型CRISPRであるCas3は、リール状にDNAをたぐり寄せるかたちでDNA上を移動しつつ、シュレッダーのように約100 kbに及ぶ長鎖DNAを一方向性に分解することを特徴としている。本研究では、CRISPR/Cas9で得られている知見・理解を基盤とし、ゲノム改変リスクを最少化する目的でペリセントロメア領域に対する染色体分解や、標的染色体へのエピゲノム修飾によるゲノム改変フリーの染色体消去をCRISPR/Cas3を含めて試みる。