ヒト疾患iPS細胞を利用した膵・腸管異常症の解明と再生医療への応用

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本研究の中で我々が樹立したRFX6 +/eGFPヘテロノックイン ヒトiPS細胞を利用し、RFX6発現の上流制御機構について検討を行った。day4に胚体内胚葉を誘導、その後day10原始腸管誘導でのRFX6の発現が確認できるin vitro誘導系を用いて、胚性内胚葉から原始腸管レベルに至るまでに使用している3種の低分子化合物のいずれが決定的な要素であるかを検討し、、RFX6/GFP、前方前腸マーカーSOX2,後方前腸マーカーPDX1、中後腸マーカーCDX2にPDX１、CDX2発現上昇を引き起こし、SOX2発現に対しては抑制的な作用を。レチノイン酸は主にレチノイン酸受容体RARのアゴニストとして、また部分的にレチノイン酸X受容体RXRへのリガンドとして働き、RARとRXRはヘテロダイマーを形成して、DNA上のレチノイン酸応答エレメントRAREに特異的に結合することが知られている。前述のレチノイン酸のRFX6発現上昇への寄与については、RARアゴニストAm80を用いた実験で再現でき、RARを介した働きであることが確認できた。また、RFX6上流の候補RAREモチーフに対するRXR-RARヘテロダイマーの直接的な結合を、ゲルシフトアッセイを用いて確認した。RARA蛋白単独、RXRA蛋白単独では有意なシフトバンドを認めず、両蛋白を加えた時のみシフトバンドが確認され、非ビオチン化プローブにて競合阻害できた。これらから、候補RAREはRXR-RARヘテロダイマーに対して特異的に結合できることが確認でき、上流制御機構につき想定される機序の一端を解明した。