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インフルエンザウイルス分節化ゲノムの自己組織化に不可欠な塩基配列の決定とその応用

流感病毒分段基因组自组装必需核苷酸序列的测定及其应用

基本信息

批准号：
21K07056
负责人：
百瀬文隆
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

インフルエンザウイルスの8分節化したRNAゲノムが子孫ウイルス粒子へ選択的にパッケージングされるメカニズムは不明だが、異分節間の特異的な塩基対形成によると考えられている。本研究では、この選択的分節集合に必須の塩基配列すなわちパッケージングシグナルを1塩基解像度で決定することを目的とする。本年度は、これまで用いてきたインターカレーション法による定量RT-PCR(RT-qPCR)やサンガー法シークエンシングなどの測定手法を見直し、精度および信頼性の向上を行った。具体的には、分節比測定RT-qPCRを蛍光標識TaqManプローブによる系へ変更したほか、次世代型シークエンサーによる1分子シークエンシング系の構築を目指した。まず解析対象であるA/Puerto Rico/8/34株およびA/Aichi/2/68株の各8分節について、既存プライマーで増幅したDNA断片に結合するTaqManプローブを設計した。その際、塩基長・融点・禁忌配列など設計諸条件を最適化した。この新規プローブと既存プライマーセットを用いて計4組の「多重検出可能な異なる2分節」を決定し、10～1,000,000コピーの範囲を定量可能なRT-qPCR系を確立した。次に1分子シークエンシングにも使用する8分節共通の逆転写プライマーを設計した。これまで8分節比の測定では、各分節のDNA断片増幅用フォワードプライマー計8種を等モル混合し逆転写プライマーとしていた。新たに、8分節で共通するゲノム5'端12塩基へハイブリダイズし固有分子識別子等をテーリングさせたプライマーを作成した。このプライマー1種類のみ逆転写に使用してRT-qPCRにより8分節が均等検出できることを確認した。さらにRT-qPCR用プライマー・プローブセットは検量線不要のデジタルPCR法でも使用可能であり、高精度な8分節比の測定も可能となった。

8-segment RNA must be generated from the seed of the plant. The gene must be generated from the seed of the plant. In this study, the selection of segment sets must be based on the selection of segment sets and the determination of segment resolution. This year, the quantitative RT-PCR(RT-qPCR) method was used to improve the accuracy, reliability and simplicity of the assay. The specific RT-qPCR method for determining the ratio of different genes to different genes is described in detail below. A/Puerto Rico/8/34 strain and A/Aichi/2/68 strain were analyzed and designed to combine with existing DNA fragments. Optimization of the design conditions of the base length, melting point and taboo arrangement. 4 groups of "multiplex detection possibility 2 sub-sections" were determined, and the range of 10~1,000,000 samples was established. The second part of the article is about the design of 8 common elements. The 8-segment ratio was determined by using the DNA fragment amplification method for each segment, and the 8-segment ratio was determined by using the reverse DNA fragment amplification method. New, 8-point common, 5-point common, 5-point common, 6-point common, 5-point common, 6-common point common This is the first time that we've seen this. The RT-qPCR method can be used with high accuracy and 8-segment ratio.