Development of high-sensitivity detection technology for nucleic acid amplification using metal and metal chelator and verification of its practicality

現在、ウイルスや細菌の検出，また，癌やその他の疾患の潜在的なバイオマーカーとして生体内で循環するmiRNAなどの核酸に着目した検査が臨床において用いられおり、今後さらにその需要が高まると予想される。核酸を用いた検査には、目的とする遺伝子の増幅が不可欠であり、これまでにもいろいろな増幅技術が開発され実用化されてきた。一方，増幅の程度を検出する技術においては、その多くが蛍光を標識した高価なプローブを用いた検出法であることから、励起装置や蛍光を検出する特別な機器が必須となる。そこで、本研究では，核酸の増幅時に副二次的に生成されるピロリン酸に着目し、酵素を用いてこのピロリン酸を低価格で高感度に検出することで、特別な機器や分析環境条件を問わない、かつ、目視にて検出可能な、より簡便な核酸増幅量の検出技術と核酸定量の開発を試み、本法の技術応用の可能性について探索・検証を行うこととする。これまでにピロリン酸検出の基本的な反応系の構築を水溶液ベースに置いて確立するに至ったが、本年度は、実際に核酸増幅後の試料を用いて検討を試みたところ、水溶液ベースと比較して何らかの反応の阻害が起きていることが判明した。そこで、阻害物質の特定と回避策を検討した結果、これらを回避する方法を見出すに至った。今後は、構築した方法を用いて、既存の核酸増幅技術との検出に関する比較検討を行う予定である。具体的には、増幅時間（サイクル数）を既存の方法と比較することで、本法の検出技術の有用性を評価するとともに、臨床展開への可能性についても検証を行う予定である。

現在、ウイルスや細菌の検出，また，癌やその他の疾患の潜在的なバイオマーカーとして生体内で循環するmiRNAなどの核酸に着目した検査が臨床において用いられおり、今後さらにその需要が高まると予想される。核酸を用いた検査には、目的とする遺伝子の増幅が不可欠であり、これまでにもいろいろな増幅技術が開発され実用化されてきた。一方，増幅の程度を検出する技術においては、その多くが蛍光を標識した高価なプローブを用いた検出法であることから、励起装置や蛍光を検出する特別な機器が必須となる。そこで、本研究では，核酸の増幅時に副二次的に生成されるピロリン酸に着目し、酵素を用いてこのピロリン酸を低価格で高感度に検出することで、特別な機器や分析環境条件を問わない、かつ、目視にて検出可能な、より簡便な核酸増幅量の検出技術と核酸定量の開発を試み、本法の技術応用の可能性について探索・検証を行うこととする。これまでにピロリン酸検出の基本的な反応系の構築を水溶液ベースに置いて確立するに至ったが、本年度は、実際に核酸増幅後の試料を用いて検討を試みたところ、水溶液ベースと比較して何らかの反応の阻害が起きていることが判明した。そこで、阻害物質の特定と回避策を検討した結果、これらを回避する方法を見出すに至った。今後は、構築した方法を用いて、既存の核酸増幅技術との検出に関する比較検討を行う予定である。具体的には、増幅時間（サイクル数）を既存の方法と比較することで、本法の検出技術の有用性を評価するとともに、臨床展開への可能性についても検証を行う予定である。