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高機能等温核酸増幅酵素の創製と構造解析および病原体の現場での迅速検出への応用

高性能等温核酸扩增酶的构建、结构分析及其在病原快速现场检测中的应用

基本信息

批准号：
22H03332
负责人：
保川清
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）を大腸菌で発現させ菌体から調製した。PKを使用したRPAは、従来から使用されているウサギクレアチンキナーゼ（CKr）を使用したRPAと同等の性能を有した。PKはCKrよりも高い耐熱性を有したことから、PKを使用したRPA試薬の高い保存安定性が示唆された。②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)から好熱性のPol（H1-PolとC1-Pol）を単離した。そしてH1-PolとC1-Polを大腸菌で発現させ菌体から精製した。H1-PolあるいはC1-Polを使用したRPAは、従来から使用されているBacillus stearothermophilus由来Pol（Bst-Pol）を使用したRPAよりも高い感度を有した。H1-Polを使用したRPAの凍結乾燥試薬は、少なくとも2週間室温に置いても、液状試薬と同程度の性能を有した。このことから、本凍結乾燥試薬は現場での使用に適していることが示唆された。③中温性のRecであるuvsYの溶解度を上げるために、Lys91-Glu134に変異を導入した全アミノ酸スキャニングライブラリーを作製した。600クローンをスクリーニングの結果、有望な変異体16種を単離した。

In this study, the most interesting results were obtained by isothermal nucleic acid method, isothermal nucleic acid method (RPA method), the use of isothermal nucleic acid method (RPA method), the use of isothermal nucleic acid method (RPA method), the use of isothermal nucleic acid (Isothermic nucleic acid method), the method of isothermal nucleic acid (Nucleic acid), the method of isothermal nucleic acid (Nucleic acid), the method of isothermal nucleic acid (Nucleic acid), the method of isothermal nucleic acid (Nucleic acid), the method of isothermal nucleic acid (Isothermic nucleic acid), the method of isothermal nucleic acid (Nucleic acid). The whole body is full of acid and acid, so that you can get into the law. Rec, SSB, Pol, ARE and active stability of sexual microorganisms are better than those of sexual microorganisms. 1. The medium temperature ARE fungus was found to be sour and sour. (competition) the bacteria were found to be infected by bacteria. Compete for the use of equivalent RPA, competitor RPA, performance equivalents (CKr). The competition for "CKr" and "high tolerance" is due to the use of "RPA" and "high stability". 2 good sex bacteria, Aeribacillus pallidus (H1), Geobacillus zalihae (C1), good sex, Pol (H1-Pol sex C1-Pol), isolation. The H1-Pol was C1-Pol and the fungus was found to be fine. H1-Pol RPA C1-Pol uses "RPA", "Lai" uses "Bacillus stearothermophilus", "Pol" (Bst-Pol) "uses"RPA", "high sensitivity". H1-Pol uses low temperature RPA to dry the oven, lower temperature to room temperature, and liquid temperature to the same degree. Please tell me that when you are dry and dry, you will be told that you are not in the market. 3. The solubility of Rec, uvsY, and Lys91-Glu134 in the solubility of medium temperature, the total temperature, acid, acid and acid. The results of the 600-year-old test are expected to be 16-year-old.