新規蛋白質NT5DC2のカテコールアミン合成における機能の解明：精神疾患との関連

阐明新型蛋白质 NT5DC2 在儿茶酚胺合成中的功能：与精神疾病的关联

• 批准号: 21K07530
• 负责人: 中島 昭
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Fujita Health University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07530/
• 关键词: NT5DC2; チロシン水酸化酵素; パーキンソン病; カテコールアミン; 精神疾患

我々は、機能不明の細胞内タンパク質NT5DC2がカテコールアミン合成を抑制することを2019年に発見した。カテコールアミン合成経路におけるNT5DC2の役割を明確にするため、NT5DC2がフォスファターゼとして機能するかどうかに着目して解析を進めた。１）NT5DC2がチロシン水酸化酵素のリン酸化に及ぼす影響：　①NT5DC2発現ベクターおよびNT5DC2分子にFlag-tagを組み込んだ発現ベクターを作製した。これをPC12D細胞内で過剰発現させた後、細胞内で発現しているチロシン水酸化酵素のリン酸化の変化をウェスタンブロット法で解析した。　②ヒトチロシン水酸化酵素のcDNAを組み込んだベクターを用いて大腸菌内で強制発現後、ヒトチロシン水酸化酵素を均一のタンパク質として精製した。次いで、ヒトチロシン水酸化酵素にキナーゼを添加して、試験管内でリン酸化チロシン水酸化酵素を作製した。このリン酸化チロシン水酸化酵素を用いて、NT5DC2による脱リン酸化作用を解析した。２）NT5DC2の機能解析：　Flag-tagを組み込んだ発現ベクターをPC12D細胞内で過剰発現させた後、磁器ビーズを用いてNT5DC2を均一なタンパク質として精製した。この精製NT5DC2にフォスファターゼの合成低分子基質を加え、酵素活性を解析した。３）NT5DC2へ結合するタンパク質の網羅的解析：　NT5DC2-Flag-tag発現ベクターをPC12D細胞内で過剰発現させ、磁気ビーズを用いてNT5DC2-Flag-tagを精製した。これをトリプシン分解後、生成したペプチドをLC-MS/MSを用いてプロテオーム解析して、NT5DC2に結合するタンパク質の網羅的に同定した。この実験は2022年度も行ったが、さらに精度を上げることで標的タンパク質を絞り込んだ。

I 々 は, function unknown の intracellular タ ン パ ク qualitative NT5DC2 が カ テ コ ー ル ア ミ ン synthetic を inhibit す る こ と を 2019 に 発 see し た. カ テ コ ー ル ア ミ ン synthetic 経 road に お け る NT5DC2 の "を clear cut に す る た め, NT5DC2 が フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ と し て function す る か ど う か に with mesh し て parsing を into め た. 1) NT5DC2 が チ ロ シ ン acidic enzyme の リ ン acidification に and ぼ す effects: (1) NT5DC2 発 now ベ ク タ ー お よ び NT5DC2 molecular に Flag - tag を group み 込 ん だ 発 now ベ ク タ ー を cropping し た. こ れ を PC12D cells で before turning 発 now さ せ た, cells after で 発 now し て い る チ ロ シ ン acidic enzyme の リ ン acidification の variations change を ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト method で し た. (2) ヒ ト チ ロ シ ン acidic enzyme の cDNA を group み 込 ん だ ベ ク タ ー を with い て で forced 発 presently after, within the coliform ヒ ト チ ロ シ ン acidic enzyme を uniform の タ ン パ ク qualitative と し て refined し た. Time い で, ヒ ト チ ロ シ ン acidic enzyme に キ ナ ー ゼ を add し て, test tube で リ ン acidification チ ロ シ ン acidic enzyme を cropping し た. <s:1> リ <s:1> acidification チロシ <s:1> water acidification enzyme を deacidification リ deacidification action を analysis of た た. 2) NT5DC2 の function resolution: Flag - tag を group み 込 ん だ 発 now ベ ク タ ー を PC12D cells で before turning 発 now さ せ た, magnetic device after ビ ー ズ を with い て NT5DC2 を uniform な タ ン パ ク qualitative と し て refined し た. <s:1> refined NT5DC2にフォスファタ ゼ ゼ <s:1> synthesis of low-molecular-weight matrix を addition え enzyme activity を analysis た た. 3) NT5DC2 へ combining す る タ ン パ ク qualitative の snare analytic: NT5DC2 - Flag - tag 発 now ベ ク タ ー を PC12D cells で before turning 発 now さ せ, magnetic 気 ビ ー ズ を with い て NT5DC2 - Flag - tag を refined し た. こ れ を ト リ プ シ ン after decomposition, generate し た ペ プ チ ド を LC - MS/MS を い て プ ロ テ オ ー ム parsing し て, NT5DC2 に combining す る タ ン パ ク qualitative の snare に with fixed し た. こ の be 験 は line 2022 も っ た が, さ ら に precision on を げ る こ と で mark タ ン パ ク qualitative を ground り 込 ん だ.