新規蛋白質NT5DC2のカテコールアミン合成における機能の解明：精神疾患との関連

阐明新型蛋白质 NT5DC2 在儿茶酚胺合成中的功能：与精神疾病的关联

基本信息

批准号：
21K07530
负责人：
中島昭
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、機能不明の細胞内タンパク質NT5DC2がカテコールアミン合成を抑制することを2019年に発見した。カテコールアミン合成経路におけるNT5DC2の役割を明確にするため、NT5DC2がフォスファターゼとして機能するかどうかに着目して解析を進めた。１）NT5DC2がチロシン水酸化酵素のリン酸化に及ぼす影響：　①NT5DC2発現ベクターおよびNT5DC2分子にFlag-tagを組み込んだ発現ベクターを作製した。これをPC12D細胞内で過剰発現させた後、細胞内で発現しているチロシン水酸化酵素のリン酸化の変化をウェスタンブロット法で解析した。　②ヒトチロシン水酸化酵素のcDNAを組み込んだベクターを用いて大腸菌内で強制発現後、ヒトチロシン水酸化酵素を均一のタンパク質として精製した。次いで、ヒトチロシン水酸化酵素にキナーゼを添加して、試験管内でリン酸化チロシン水酸化酵素を作製した。このリン酸化チロシン水酸化酵素を用いて、NT5DC2による脱リン酸化作用を解析した。２）NT5DC2の機能解析：　Flag-tagを組み込んだ発現ベクターをPC12D細胞内で過剰発現させた後、磁器ビーズを用いてNT5DC2を均一なタンパク質として精製した。この精製NT5DC2にフォスファターゼの合成低分子基質を加え、酵素活性を解析した。３）NT5DC2へ結合するタンパク質の網羅的解析：　NT5DC2-Flag-tag発現ベクターをPC12D細胞内で過剰発現させ、磁気ビーズを用いてNT5DC2-Flag-tagを精製した。これをトリプシン分解後、生成したペプチドをLC-MS/MSを用いてプロテオーム解析して、NT5DC2に結合するタンパク質の網羅的に同定した。この実験は2022年度も行ったが、さらに精度を上げることで標的タンパク質を絞り込んだ。

我们在2019年发现，未知功能的细胞内蛋白NT5DC2抑制了儿茶酚胺的合成。为了阐明NT5DC2在儿茶酚胺合成途径中的作用，进行了分析，重点是NT5DC2是否起磷酸酶的作用。 1）NT5DC2对酪氨酸羟化酶磷酸化的影响：1）表达载体，其中将FLAG-TAG掺入NT5DC2表达载体中，制备了NT5DC2分子。在PC12D细胞中过表达之后，通过蛋白质印迹分析了在细胞中表达的酪氨酸羟化酶的磷酸化变化。 2）使用掺入人类酪氨酸羟化酶cDNA的载体强迫表达大肠杆菌后，人类酪氨酸羟化酶被纯化为均质蛋白。接下来，将激酶添加到人酪氨酸羟化酶中，在试管中产生磷酸化的酪氨酸羟化酶。这种磷酸化的酪氨酸羟化酶用于分析NT5DC2的去磷酸化作用。 2）NT5DC2的功能分析：在PC12D细胞中过表达掺入FLAG-TAG的表达载体后，使用瓷珠将NT5DC2纯化为均质蛋白。将磷酸酶的小合成底物添加到该纯化的NT5DC2中，并分析了酶活性。 3）对与NT5DC2结合的蛋白质的全面分析：在PC12D细胞中过表达NT5DC2-FLAG-TAG表达载体，并使用磁珠纯化NT5DC2-FLAG-TAG。胰蛋白酶吸引后，使用LC-MS/MS对所得的肽进行蛋白质组学分析，以全面鉴定与NT5DC2结合的蛋白质。该实验是在2022年进行的，但是通过进一步提高准确性，我们缩小了靶蛋白。