重粒子線照射に特徴的なDNA二本鎖切断の修復機構の解析

昨年度と同様に、ヒトHeLa細胞にX線あるいは重粒子線（線エネルギー付与率：80-300 keV/micrometer)を照射した後にクロマチン結合画分を得て、DNA損傷に応じてクロマチン上にリクルートされてくる修復タンパク質をウエスタンブロットにより解析した。その結果、DNA二本鎖末端の齧り込みを促進するCtIPのリン酸化は、X線に比べて重粒子線の方が促進されていることが判明した。この結果は、Ｘ線に比べて重粒子線の場合は、非相同末端結合以外の三つの修復経路（相同組換え、一本鎖アニーリング、代替的非相同末端結合）が起こりやすくなっていることを示唆している。また、相同組換えと一本鎖アニーリングに関与するRad52は、X線に比べて重粒子線の方がクロマチンへの結合量が多かった。さらに、Rad52の一部は、線量に依存して10kDa程度分子量が増加する翻訳後修飾が起きており、その修飾もＸ線に比べて重粒子線の方が顕著であった。昨年度明らかにしたRad51の動態に関する解析結果とも合わせると、重粒子線の場合は5Gy程度までは相同組換えが機能するが、その後は相同組換えに代わり一本鎖アニーリングが起きやすくなっていると考えられる。一方、代替的非相同末端結合に関与するDNAポリメラーゼシータは、放射線照射に依存したクロマチン結合を生化学的分画法や蛍光抗体法による局在変化により検出することが困難であり、その動態を明らかにすることができなかった。Rad52の翻訳後修飾に関してX線照射による解析を行い、X線照射後まもなく修飾が起きていること、修飾は細胞周期に依存しておりG1期よりもG2期に顕著であること、また複製阻害剤処理によっても同様の修飾が起きることを明らかにした。

昨年度と同様に、ヒトHeLa細胞にX線あるいは重粒子線（線エネルギー付与率：80-300 keV/micrometer)を照射した後にクロマチン結合画分を得て、DNA損傷に応じてクロマチン上にリクルートされてくる修復タンパク質をウエスタンブロットにより解析した。その結果、DNA二本鎖末端の齧り込みを促進するCtIPのリン酸化は、X線に比べて重粒子線の方が促進されていることが判明した。この結果は、Ｘ線に比べて重粒子線の場合は、非相同末端結合以外の三つの修復経路（相同組換え、一本鎖アニーリング、代替的非相同末端結合）が起こりやすくなっていることを示唆している。また、相同組換えと一本鎖アニーリングに関与するRad52は、X線に比べて重粒子線の方がクロマチンへの結合量が多かった。さらに、Rad52の一部は、線量に依存して10kDa程度分子量が増加する翻訳後修飾が起きており、その修飾もＸ線に比べて重粒子線の方が顕著であった。昨年度明らかにしたRad51の動態に関する解析結果とも合わせると、重粒子線の場合は5Gy程度までは相同組換えが機能するが、その後は相同組換えに代わり一本鎖アニーリングが起きやすくなっていると考えられる。一方、代替的非相同末端結合に関与するDNAポリメラーゼシータは、放射線照射に依存したクロマチン結合を生化学的分画法や蛍光抗体法による局在変化により検出することが困難であり、その動態を明らかにすることができなかった。Rad52の翻訳後修飾に関してX線照射による解析を行い、X線照射後まもなく修飾が起きていること、修飾は細胞周期に依存しておりG1期よりもG2期に顕著であること、また複製阻害剤処理によっても同様の修飾が起きることを明らかにした。