1細胞解析を用いた放射線治療による腫瘍微小環境、免疫応答変化の解析

使用单细胞分析分析放疗引起的肿瘤微环境和免疫反应变化

• 批准号: 21K07661
• 负责人: 北條 秀博
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: National Cancer Center Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07661/
• 关键词: 1細胞解析; 食道癌; 放射線治療; PD-L1; マクロファージ; 免疫応答; 腫瘍微小環境

患者同意が得られた計5例の放射線治療対象の食道扁平上皮癌患者から採取した治療前（3例）、治療中～治療後7日以内（4例）、治療後1か月後（2例）の組織検体を用いたSingle cell RNA sequencingを施行した。上部消化管内視鏡にて採取された生検検体をMACS;Tissue Dissociation Kits (Miltenyi Biotec)を用いて細胞分離を行い、Single Cell 5' v1 Dual Index Gene Expression Libraries kit (10X Genomics)を用いてライブラリを作成し、Novaseq6000によるsequenceを行った。得られたFASTQファイルからR v4, Seurat v4、SingleRを用いてCell annotation, Gene expression analysis, Clustering analysis, 遺伝子発現解析を行った。その結果、放射線治療前、治療後いずれからも10000を超える細胞の単離、遺伝子発現解析が可能であった。細胞レベルでは放射線照射後にリンパ球の減少、マクロファージの増加が確認され、遺伝子発現レベルでも放射線によるIFN応答の増強や、VEGF pathwayの活性化などが確認された。2022年度の成果として、前年度で解析した細胞群のうち、Macrophage、Monocyte、Dendritic cellの一部に、放射線治療後、PD-L1を強く発現する細胞群を見出している。さらにこの細胞群は、SIRPA, IDO1等の免疫抑制遺伝子を同時に強く発現する細胞であることも確認している。このような細胞群は、放射線治療と併用する免疫治療の標的となりえる可能性が高く、今後癌組織内での局在や、機能について解析を進める予定である。

The patients agreed to receive radiotherapy in 5 patients with esophageal flat epithelial carcinoma before treatment (n = 3), within 7 days after treatment (n = 4), and 1 month after treatment (n = 2). Tissue Single cell RNA sequencing was used to perform surgery. In the upper digestive tract, MACS;Tissue Dissociation Kits (Miltenyi Biotec) was used to separate cells, Single Cell 5' v1 Dual Index Gene Expression Libraries kit (10x Genomics) was made from cells, and Novaseq6000 was used to separate cells. You can use Cell annotation, Gene expression analysis, Clustering analysis, SingleR to parse the lines of FASTQ. The results showed that 10000 of the patients were isolated before and after radiation therapy, and the results were analyzed. After exposure to radiation, there are fewer balls in the cell, so that you can make sure that there is a difference in the number of radiation lines, that is, the IFN should be enhanced, and the VEGF pathway should be activated. The results of the year 2022, the previous year's analysis, Macrophage, Monocyte, Dendritic cell, and after radiation therapy, the PD-L1 strongly demonstrated that the cell population had a positive response. Immunosuppressive cell populations, SIRPA, IDO1 and other immunosuppressive agents should be strengthened at the same time to make sure that they are infected. There is a high probability of cancer cell population, radiation therapy and immunotherapy. In the future, the cancer tissue will be affected, and the prediction will be made by the analysis of the potential of cancer tissue.