Elucidation of intra-ciliary signals that control the onset of nephronophthisis

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細胞内小器官である一次線毛の欠失や構造・機能異常は腎臓のみならず、多くの組織・器官に異常をもたらす。ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は、主に一次線毛に局在する。最近、研究代表者はNPHPの一種であるANKS６（NPHP16） のリン酸化がネフロン癆モデルマウスの腎臓で阻害されていることを報告した。ネフロン癆発症機序の解明を目的としてANKS６ のリン酸化の意義を明らかにするために、まずリン酸化されているANKS６のアミノ酸残基を同定することを試みた。　樹立済みのマウス近位尿細管上由来の培養細胞（Dai1細胞）に対して、CRISPR/Cas9 システムを利用してANKS６遺伝子のN末端にPAタグを読み枠が合うようにデザインし、ゲノム編集を行なった。作製したPAタグN末端付加ANKS６ 安定発現細胞株から、タグに対する抗体で免疫沈降を行い、溶出液をSDS-PAGEで分離し、ゲルを銀染色した。その結果、分子量からANKS６と推測されるバンドが銀線色によって検出されたため、その部位のゲルを切り出し、理化学研究所に質量分析を依頼した。質量分析の結果、ANKS６の７３２番目のセリンをリン酸化部位として同定した。現在、ANKS６の７３２番目のセリンをアラニンに置換してリン酸化ができないアミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製を行なっており、この変異体ES細胞を用いてキメラマウスの作製を予定している。