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Elucidation of intra-ciliary signals that control the onset of nephronophthisis

阐明控制肾结核发作的纤毛内信号

基本信息

批准号：
21K08259
负责人：
中島由郎
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08259/
关键词：
ネフロン癆一次線毛 ANKS6 リン酸化嚢胞腎 RNA結合タンパク質尿細管

项目摘要

細胞内小器官である一次線毛の欠失や構造・機能異常は腎臓のみならず、多くの組織・器官に異常をもたらす。ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は、主に一次線毛に局在する。最近、研究代表者はNPHPの一種であるANKS６（NPHP16）のリン酸化がネフロン癆モデルマウスの腎臓で阻害されていることを報告した。ネフロン癆発症機序の解明を目的としてANKS６のリン酸化の意義を明らかにするために、まずリン酸化されているANKS６のアミノ酸残基を同定することを試みた。　樹立済みのマウス近位尿細管上由来の培養細胞（Dai1細胞）に対して、CRISPR/Cas9 システムを利用してANKS６遺伝子のN末端にPAタグを読み枠が合うようにデザインし、ゲノム編集を行なった。作製したPAタグN末端付加ANKS６安定発現細胞株から、タグに対する抗体で免疫沈降を行い、溶出液をSDS-PAGEで分離し、ゲルを銀染色した。その結果、分子量からANKS６と推測されるバンドが銀線色によって検出されたため、その部位のゲルを切り出し、理化学研究所に質量分析を依頼した。質量分析の結果、ANKS６の７３２番目のセリンをリン酸化部位として同定した。現在、ANKS６の７３２番目のセリンをアラニンに置換してリン酸化ができないアミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製を行なっており、この変異体ES細胞を用いてキメラマウスの作製を予定している。

Small organs in the cell are damaged by primary hair, structure and function, and many tissues and organs are abnormal. NPHP is the primary product of the primary line. Recently, research representatives have reported on the development of ANKS6 (NPHP16), a type of NPHP, which is resistant to kidney disease. The purpose of this study is to clarify the mechanism of the development of ANKS6 and to clarify the significance of ANKS6 in the development of ANKS6. The CRISPR/Cas9 gene system was used to construct the N-terminal PA gene of ANKS6 gene, which was derived from cultured cells (Dai1 cells) near urine tubule. ANKS6 was added to the N-terminal of PA to produce stable cell lines, and the antibody was isolated by SDS-PAGE and silver staining. The results, molecular weight, and molecular weight of the sample were determined by mass spectrometry at the Institute of Physical Chemistry. The results of mass analysis, ANKS6 and 732 were determined by the same method. Now, ANKS6 732 is introduced into ES cells and the operation of ES cells is determined.