膿疱症におけるIL-36カスケードの解明

阐明脓疱病中 IL-36 级联反应

• 批准号: 21K08298
• 负责人: 藤本 徳毅
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08298/
• 关键词: IL-36; IL36RN; IL-38; Cas9; ゲノム編集; 膿疱症

lentiCRISPR v2を用いてIL36RN遺伝子をノックアウトしたHaCaT細胞の複数のクローンでIL-36Raタンパクの発現を検討したところ、ウエスタンブロットではたんぱくの発現は消失していたがqPCRではmRNAは発現は認め、一定しない結果であった。そのため、ウエスタンブロットでIL-36Raをうまく同定出来ていない可能性があり、IL-36Raの発現に関しての検討を行った。まずは、HaCaT細胞においてqPCRでIL36RN mRNAの発現が増加する条件を探した。過去の報告ではTNF-a＋IL-17Aの刺激で強く発現するということであったが、TNF-a+IL-17AやIL-1b、LPSなどの刺激では増加せず、EGFR阻害薬やMEK阻害薬ではほとんど減少せず、TNF-a刺激24時間後に２倍程度の増加が見られた。しかし、実験によりかなり発現のバラツキが大きかった。我々の過去の報告でも、掌蹠膿疱症などの膿疱性疾患の皮疹部での免疫組織化学染色では顆粒層に強く発現しており、培養角化細胞におけるIL-36Raの発現は、細胞の分化、角化の程度によりかなり影響される可能性を考えた。すなわち、HaCaT細胞の分化がIL-36Ra発現に影響を与える仮説のもと、高カルシウムの培養液で培養したHaCaT細胞を用いて、各種刺激とIL-36Raの発現を検討しているところである。また、ウエスタンブロットに関しては、血清やスキムミルクでブロッキングしてモノクローナル抗体で同定する方法では、IL-36Raタンパクを十分に濃いバンドで同定出来ないことが判明した。種々の条件を試した結果、ブロッキングせずにポリクローナルな抗体を用いれば、十分濃いシングルバンドが同定できることが分かった。現在、IL36RN遺伝子だけではく、IL38遺伝子をノックアウトしたHaCaT細胞も平行して作成中である。

lentiCRISPR V2 を with い て IL36RN heritage 伝 son を ノ ッ ク ア ウ ト し た HaCaT cells の plural の ク ロ ー ン で IL - 36 ra タ ン パ ク の 発 を now beg し 検 た と こ ろ, ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト で は た ん ぱ く の 発 は disappear now し て い た が qPCR で は mRNA は 発 は now recognize め, certain し な い results で あ っ た. そ の た め, ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト で IL - 36 ra を う ま く with set out て い な い possibility が あ り, IL - 36 ra の 発 now に masato し て の 検 line for を っ た. Youdaoplaceholder0 まず, HaCaT cells にお て てqPCRでIL36RN mRNA にお occurrence が increase する conditions を to detect た. Past の report で は TNF - a + IL - 17 - a の strong stimulation で く 発 now す る と い う こ と で あ っ た が, TNF - a + IL - 17 a や IL - 1 b, LPS な ど の stimulus で は raised plus せ ず, EGFR inhibitor 薬 や MEK resistance against 薬 で は ほ と ん ど reduce せ ず, TNF - a stimulus after 24 time に add が の raised double degree See られた. The によ によ な な present によ バラ キが キが large によ った った った I 々 の past の report で も, palm, study pustules な ど の の pustular disease rash department で の immunohistochemical staining で は granular layer に strong く 発 now し て お り, cultivating keratinocytes に お け る IL - 36 ra の 発 の は, cell differentiation, degree of diversification の に よ り か な り influence さ れ る possibility を exam え た. す な わ ち, HaCaT cells の が IL - 36 ra 発 に influence を and え る 仮 said の も と, high カ ル シ ウ ム で の broth culture し た HaCaT cells を using い て, all kinds of stimulating と IL - 36 ra の 発 を now beg し 検 て い る と こ ろ で あ る. ま た, ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に masato し て は, serum や ス キ ム ミ ル ク で ブ ロ ッ キ ン グ し て モ ノ ク ロ ー ナ で ル antibody with fixed す る method で は, IL - 36 ra タ ン パ ク を grows very に い バ ン ド で with set out な い こ と が.at し た. Kind of 々 の conditions を try し た results, ブ ロ ッ キ ン グ せ ず に ポ リ ク ロ ー ナ ル を な antibody with い れ ば, very thick い シ ン グ ル バ ン ド が with fixed で き る こ と が points か っ た. Now, IL36RN but 伝 だ け で は く, IL38 but 伝 を ノ ッ ク ア ウ ト し た HaCaT cells も parallel し て in consummate で あ る.

项目成果

Elucidation of the role of IL-36 cascade in pustular skin disorders

阐明 IL-36 级联在脓疱性皮肤病中的作用

• 发表时间: 2022
• 作者: Akihiko Yamaguchi;Toshifumi Takahashi;Takashi Satoh;Noriki Fujimoto
• 通讯作者: Noriki Fujimoto