Development of a method to induce maturation of fetal hematopoietic stem cells

诱导胎儿造血干细胞成熟的方法的开发

• 批准号: 21K08431
• 负责人: 小林 央
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: National Center for Global Health and Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08431/
• 关键词: 造血幹細胞; 胎生期; 成熟; 遺伝子編集; CRISPR/Cas9; 静止期維持培養

１．造血幹細胞の成熟化マーカーの探索自身、および公共データベースのRNA-seqデータの解析およびqPCRの解析からMuc13,Spns3, Cpne2, Ndrg1が成熟に伴い上昇することを確認し、かつ上昇のタイミングがそれぞれ異なることを見出した。Muc13, Spns3が出生後4週間以内の早期に上昇するのに対し、Ndrg1は8週齢程度になるとはじめて加齢することがわかり、造血幹細胞の成熟過程は単相性ではなく複相的に進行することを示唆した。２．胎生期造血幹細胞の成熟化誘導因子の探索と成熟メカニズムの解明各種の培養条件や転写因子の過剰発現を通じて成熟化誘導因子を探索した結果、間葉系細胞株との共培養系において、骨髄環境を模倣する形で胎児造血幹細胞を成熟させかつ長期間維持可能となった。この間にMuc13, Spns3、Cpne2は生体内同様、時間経過とともに徐々に発現が亢進する一方で、特定の因子によって発現が変動するわけではなく外在性の因子ではなく造血幹細胞自身の有する内在性のプログラムが成熟過程に関わっていることが示唆された。一方、Ndrg1は生体内と異なり100日を超える長期の培養後も発現が亢進せず、共培養系から、脂質リッチな成体造血幹細胞用の培養環境に移すことで発現するようになることから、微小環境によって発現が制御されることが示唆された。３． 遺伝子機能解析のための遺伝子編集技術の開発マウスの造血幹細胞についてCRISPR/Cas9システムを用いて様々な条件を検討し、ノックアウト効率の最適化を試みた。具体的には高サイトカイン条件で16-24時間のprecultureを経た後、sgRNA+Cas9 complexを導入し、ただちに上記の造血幹細胞静止期維持培養を開始することで、10日間にわたり生着可能な造血幹細胞を維持した(Cell Rep Methods, 2022)

1. Hematopoietic stem cell maturation: exploration of self, identification of RNA-seq data, analysis of qPCR, identification of Muc13,Spns3, Cpne2, Ndrg1 maturation, identification of rise, identification of rise, and identification of differences Muc13, Spns3: Early rise within 4 weeks after birth, Ndrg1:8 weeks after birth, maturation of hematopoietic stem cells: uniphasic, multiphasic. 2. The study of maturation induction factors in fetal hematopoietic stem cells; the study of maturation induction factors in fetal hematopoietic stem These genes Muc13, Spns3 and Cpne2 are related to the development of in vivo identity, time lapse, and specific factors, while exogenous factors are related to the development and maturation of hematopoietic stem cells themselves. In vivo, Ndrg1 was found to be different after 100 days of long-term culture, co-culture system, lipid separation, and adult hematopoietic stem cells were found in culture environment, and microenvironment was found to be resistant to growth. 3. CRISPR/Cas9 system is used in the development of hematopoietic stem cells. The conditions for CRISPR/Cas9 system development are discussed and the efficiency of CRISPR/Cas9 system is optimized. Specific conditions include 16-24 hours of preculture, sgRNA+Cas9 complex introduction, and 10 days of maintenance of hematopoietic stem cells (Cell Rep Methods, 2022)

项目成果

Context-dependent modification of PFKFB3 in hematopoietic stem cells promotes anaerobic glycolysis and ensures stress hematopoiesis

• DOI: 10.1101/2023.03.16.532898
• 发表时间: 2023-11
• 期刊: eLife
• 影响因子: 7.7
• 作者: Shintaro Watanuki;Hiroshi Kobayashi;Yuki Sugiura;M. Yamamoto;Daiki Karigane;K. Shiroshita;Yuriko Sorimachi;Shinya Fujita;T. Morikawa;S. Koide;M. Oshima;Akira Nishiyama;Koichi Murakami;Miho Haraguchi;Shinpei Tamaki;Takehiro Yamamoto;Tomohiro Yabushita;Yosuke Tanaka;Go Nagamatsu;Hiroaki Honda;Shinichiro Okamoto;N. Goda;Tomohiko Tamura;A. Nakamura-Ishizu;M. Suematsu;Atsushi Iwama;Toshio Suda;K. Takubo

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

维持静止人类造血干细胞的培养方法

• DOI: 10.3791/61938
• 发表时间: 2021
• 期刊: J Vis Exp
• 作者: Mochizuki-Kashio Makiko;Shiozaki Hiroko;Suda Toshio;Nakamura-Ishizu Ayako;Kobayashi H,?Takubo K.
• 通讯作者: Kobayashi H,?Takubo K.