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緑膿菌線毛蛋白DNAと樹状細胞リガンドDNAワクチンによる緑膿菌肺炎制御の可能性

使用铜绿假单胞菌菌毛蛋白 DNA 和树突状细胞配体 DNA 疫苗控制铜绿假单胞菌肺炎的可能性

基本信息

批准号：
21K08508
负责人：
平松和史
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度作成した緑膿菌標準株であるPAO1株の線毛遺伝子であるpilA遺伝子をT-Vectorに挿入したプラスミドpilA-T-Vectorをcompetent cellである大腸菌に導入し、大腸菌を大量に培養した。培養した大腸菌からプラスミド抽出用キットを用いて、pilA-T-Vectorを大量に抽出した。抽出したpilA T-Vectorを制限酵素で切断し、アガロースゲルにて電気泳動を行い、pilA遺伝子の大きさに該当する450bp付近のバンドを切り出し、DNAを抽出した。抽出したpilA遺伝子をサイトメガロウイルスのプロモーターを有するDNAワクチン用ベクターpVAX1のmultiple cloning siteにligation kitを用いて挿入した。ligation後、competent cellの大腸菌に導入した。pVAX１はkanamycin耐性遺伝子を有しているため、kanamycin含有寒天培地上で遺伝子導入した大腸菌を増殖させることで、プラスミド導入の有無を判別した。発育したコロニーを釣菌し、それぞれをkanamycin含有液体培地で培養し、培養した大腸菌のプラスミドをプラスミド抽出キットにより抽出した。取り出したpVAX1にpilA遺伝子が間違いなく挿入されているかどうかを得られたプラスミドを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行うことで確認した。電気泳動によって450bp付近にバンドが認められたクローンをpilAがpVAX1に導入されたものと判断した。450bp付近にバンドが認められたプラスミドについては、設計通りにpilA遺伝子がpVAX1プラスミドに挿入されているかどうかを確認するため、塩基配列決定の実験準備を行っている。

In the previous year, the standard strain of bacteria, PAO1, pilA, pilA, T-Vector, imported, pilA-T-Vector, competent cell, and large numbers of bacteria were introduced. The bacteria were used to extract the bacteria and the pilA-T-Vector was used to extract a large number of bacteria. Extract pilA T-Vector to make enzyme restriction enzyme cutoff, DNA electrophoretic swimming exercise, DNA electrophoretic electrophoretic exercise, and DNA electrophoretic digestion. Pull out the pilA multiple cloning site sub-unit and use the pVAX1 multiple cloning site ligation kit to enter the database. After ligation, competent cell bacteria were introduced into the bacteria. The pVAX1 kanamycin tolerance test was positive, while the kanamycin was positive in cold weather, and was not identified when cultured in cold weather. The bacteria and kanamycin contain liquid culture, and the bacteria are extracted from the bacteria. Check out the pVAX1 pilA system to make sure that the enzyme restriction enzyme is cut off and the swimming activity is confirmed. Electrophoretic exercise