緑膿菌線毛蛋白DNAと樹状細胞リガンドDNAワクチンによる緑膿菌肺炎制御の可能性

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前年度作成した緑膿菌標準株であるPAO1株の線毛遺伝子であるpilA遺伝子をT-Vectorに挿入したプラスミドpilA-T-Vectorをcompetent cellである大腸菌に導入し、大腸菌を大量に培養した。培養した大腸菌からプラスミド抽出用キットを用いて、pilA-T-Vectorを大量に抽出した。抽出したpilA T-Vectorを制限酵素で切断し、アガロースゲルにて電気泳動を行い、pilA遺伝子の大きさに該当する450bp付近のバンドを切り出し、DNAを抽出した。抽出したpilA遺伝子をサイトメガロウイルスのプロモーターを有するDNAワクチン用ベクターpVAX1のmultiple cloning siteにligation kitを用いて挿入した。ligation後、competent cellの大腸菌に導入した。pVAX１はkanamycin耐性遺伝子を有しているため、kanamycin含有寒天培地上で遺伝子導入した大腸菌を増殖させることで、プラスミド導入の有無を判別した。発育したコロニーを釣菌し、それぞれをkanamycin含有液体培地で培養し、培養した大腸菌のプラスミドをプラスミド抽出キットにより抽出した。取り出したpVAX1にpilA遺伝子が間違いなく挿入されているかどうかを得られたプラスミドを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行うことで確認した。電気泳動によって450bp付近にバンドが認められたクローンをpilAがpVAX1に導入されたものと判断した。450bp付近にバンドが認められたプラスミドについては、設計通りにpilA遺伝子がpVAX1プラスミドに挿入されているかどうかを確認するため、塩基配列決定の実験準備を行っている。