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緑膿菌線毛蛋白DNAと樹状細胞リガンドDNAワクチンによる緑膿菌肺炎制御の可能性

使用铜绿假单胞菌菌毛蛋白 DNA 和树突状细胞配体 DNA 疫苗控制铜绿假单胞菌肺炎的可能性

基本信息

批准号：
21K08508
负责人：
平松和史
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度作成した緑膿菌標準株であるPAO1株の線毛遺伝子であるpilA遺伝子をT-Vectorに挿入したプラスミドpilA-T-Vectorをcompetent cellである大腸菌に導入し、大腸菌を大量に培養した。培養した大腸菌からプラスミド抽出用キットを用いて、pilA-T-Vectorを大量に抽出した。抽出したpilA T-Vectorを制限酵素で切断し、アガロースゲルにて電気泳動を行い、pilA遺伝子の大きさに該当する450bp付近のバンドを切り出し、DNAを抽出した。抽出したpilA遺伝子をサイトメガロウイルスのプロモーターを有するDNAワクチン用ベクターpVAX1のmultiple cloning siteにligation kitを用いて挿入した。ligation後、competent cellの大腸菌に導入した。pVAX１はkanamycin耐性遺伝子を有しているため、kanamycin含有寒天培地上で遺伝子導入した大腸菌を増殖させることで、プラスミド導入の有無を判別した。発育したコロニーを釣菌し、それぞれをkanamycin含有液体培地で培養し、培養した大腸菌のプラスミドをプラスミド抽出キットにより抽出した。取り出したpVAX1にpilA遺伝子が間違いなく挿入されているかどうかを得られたプラスミドを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行うことで確認した。電気泳動によって450bp付近にバンドが認められたクローンをpilAがpVAX1に導入されたものと判断した。450bp付近にバンドが認められたプラスミドについては、設計通りにpilA遺伝子がpVAX1プラスミドに挿入されているかどうかを確認するため、塩基配列決定の実験準備を行っている。

A standard strain of Pseudomonas aeruginosa was prepared in the previous year. A pilA vector was introduced into the pilA-T-Vector competent cell. Coliform bacteria were cultured in large quantities. Culture of Escherichia coli and extraction of pilA-T-Vector Extraction of pilA T-Vector restriction enzymes, cleavage of DNA, and electromigration of pilA DNA. The multiple cloning site of the extraction pilA gene is used to extract DNA from the pilA gene. After ligation, competent cell and coliform bacteria are introduced. pVAX1 kanamycin resistance gene is present, kanamycin contains cold culture on the ground to introduce Escherichia coli, the presence or absence of kanamycin resistance gene is determined. Culture of Escherichia coli with kanamycin Take out the pVAX1 pilA gene and check it out. The electric motor is driven by 450bp. The electric motor is driven by 450 bp. 450bp close to the site to identify, design and pass pilA gene to pVAX1 site to identify, base alignment determination and preparation.