Suppression of mammary cancer metastasis by exosome-associated gene deletion by CRISPR/Cas9 system

CRISPR/Cas9系统通过外泌体相关基因缺失抑制乳腺癌转移

• 批准号: 21K08633
• 负责人: 柴田 雅朗
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08633/
• 关键词: nSM2; Smpd3; エクソソーム; ノックアウト; ノックダウン; 乳癌; 転移; マウス; 転移抑制; CRISPR/Cas9

＜背景と目的＞　癌転移の成立には癌細胞の生着に適した転移先臓器での微小環境（前転移ニッチ）の形成が必要である。癌細胞の分泌するエクソソームには前転移ニッチを形成する能力があることや転移先臓器を規定するといった報告がある。また、癌の進展に対して促進的に作用しているとも報告されている。転移は癌による死因の殆どを占めていることから、エクソソーム分泌に関わる遺伝子を標的とする治療戦略を試みる。エクソソーム分泌に関わる遺伝子として、Neutral sphingomyelinase 2 (nSM2)、Rab27aおよびAlixの３遺伝子が知られている。そのうち、nSM2はエクソソーム形成の初期段階に関与し、他の経路と非依存的に進行することから、nSM2遺伝子（またはSphingomyelin phosphodiesterase 3、Smpd3と称される）を転移性のマウス乳癌細胞において、欠失あるいはノックダウンさせる。＜方法＞　マウスnSM2遺伝子のノックアウトベクターの作製と乳癌細胞株への遺伝子導入を株式会社セツロテックに依頼した。３種類のガイド配列を用いた乳癌細胞の中からノックアウト細胞のSingle cell cloneを順次、作製しているが、結果は芳しくなく、現時点でノックアウト細胞株を樹立していない。現在も実験中である。ノックアウトが上手くいかない場合を想定して、siRNAによるノックダウン戦略も実行してゆく。nSM2に対する有効なsiRNA配列を決定し、GFPの組み込まれたnSM2-shRNA発現ベクターを作製した。このnSM2-shRNA発現ベクターを用いて当該遺伝子をノックダウンさせる。

Background Objective: The establishment of cancer metastasis is necessary for the formation of microenvironment (pre-metastasis) for the growth of cancer cells The ability of cancer cells to secrete protein and protein is regulated. The role of cancer progression in promoting cancer development is discussed in the report. The causes of cancer are closely related to the secretion and treatment of cancer. The expression of the three genes, Neutral sphingomyelinase 2 (nSM2), Rab27a and Alix, is detected in the serum. The early stages of the formation of a good system are related to, and independent of, other pathways, and processes. NSM2 genes (Sphingomyelin phosphodiesterase 3, Smpd3) are also referred to as transitional and missing breast cancer cells. <Method> Production of NSM2 Gene and Gene Introduction of Breast Cancer Cell Co., Ltd. 3 kinds of breast cancer cells in the middle of the array, in order, in the process, in the result, in the current point, in the establishment of a Single cell clone And now you're in the middle of it. It's a good idea to use siRNA in different situations. nSM2-shRNA sequence determination, GFP sequence determination and nSM2-shRNA sequence determination The nSM2-shRNA gene was developed and used in a variety of ways.