Suppression of mammary cancer metastasis by exosome-associated gene deletion by CRISPR/Cas9 system

CRISPR/Cas9系统通过外泌体相关基因缺失抑制乳腺癌转移

基本信息

批准号：
21K08633
负责人：
柴田雅朗
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

＜背景と目的＞　癌転移の成立には癌細胞の生着に適した転移先臓器での微小環境（前転移ニッチ）の形成が必要である。癌細胞の分泌するエクソソームには前転移ニッチを形成する能力があることや転移先臓器を規定するといった報告がある。また、癌の進展に対して促進的に作用しているとも報告されている。転移は癌による死因の殆どを占めていることから、エクソソーム分泌に関わる遺伝子を標的とする治療戦略を試みる。エクソソーム分泌に関わる遺伝子として、Neutral sphingomyelinase 2 (nSM2)、Rab27aおよびAlixの３遺伝子が知られている。そのうち、nSM2はエクソソーム形成の初期段階に関与し、他の経路と非依存的に進行することから、nSM2遺伝子（またはSphingomyelin phosphodiesterase 3、Smpd3と称される）を転移性のマウス乳癌細胞において、欠失あるいはノックダウンさせる。＜方法＞　マウスnSM2遺伝子のノックアウトベクターの作製と乳癌細胞株への遺伝子導入を株式会社セツロテックに依頼した。３種類のガイド配列を用いた乳癌細胞の中からノックアウト細胞のSingle cell cloneを順次、作製しているが、結果は芳しくなく、現時点でノックアウト細胞株を樹立していない。現在も実験中である。ノックアウトが上手くいかない場合を想定して、siRNAによるノックダウン戦略も実行してゆく。nSM2に対する有効なsiRNA配列を決定し、GFPの組み込まれたnSM2-shRNA発現ベクターを作製した。このnSM2-shRNA発現ベクターを用いて当該遺伝子をノックダウンさせる。

<背景和目的>要建立癌症转移，必须在要进行转移的器官中建立微环境（前替代菌群），这是适合于雕刻癌细胞的。有报道称，由癌细胞分泌的外泌体具有形成前端壁ches的能力，并且它们定义了将向其转移的器官。据报道，它对癌症进展具有启动子的影响。转移是癌症死亡的大部分原因，因此我们尝试了一种针对与外泌体分泌基因的治疗策略。涉及外泌体分泌的三个基因是已知的：中性鞘磷脂酶2（NSM2），RAB27A和ALIX。其中，NSM2参与外泌体形成的早期阶段，并独立于其他途径进行进展，从而导致NSM2基因（或称为SMPD3）在转移性小鼠乳腺癌细胞中删除或敲定。 <方法>我们要求Setulotec Co.，Ltd。为小鼠NSM2基因创建敲除载体，并将基因引入乳腺癌细胞系。敲除细胞的单细胞克隆使用三种类型的指南序列从乳腺癌细胞中依次产生，但结果不好，目前尚未确定基因敲除细胞系。它仍在实验中。如果淘汰赛不起作用，我们还将使用siRNA实施敲低策略。确定NSM2的有效siRNA序列，并生成GFP的NSM2-shRNA表达载体。该NSM2-shRNA表达载体用于击倒基因。