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TREK-1に対する鎮痛薬の作用機序解明

阐明镇痛药对 TREK-1 的作用机制

基本信息

批准号：
21K08944
负责人：
松木悠佳
金额：
$ 2.75万
依托单位：
University of Fukui
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08944/
关键词：
イオンチャネル TREK

项目摘要

・TREK-1チャネル発現系の確立：今回用いるTREK-1は、ヒト由来のチャネルであり、大腸菌では発現しない。そのため、新たに酵母発現系を導入する必要がある。TREK1を活性化する薬物のスクリーニングに向け、本年度は酵母発現系を用いて、ヒトTREK1タンパク質の発現・精製法の構築を試みた。まず、GFP融合タンパク質としてヒトTREK1全長 (1-411 aa) を酵母に発現させたところ、細胞膜に局在したことから、ヒトTREK1は酵母内で機能体として発現すると推定した。次に、酵母を破砕し、アフィニティー精製を行ったが、TREK1の分解産物が多く十分な純度のタンパク質が得られなかった。そこで、機能ドメインを有するマウスTREK1の結晶構造を参考に、C末端側の細胞膜外領域を欠損させたヒトTREK1（1-323 aa）の発現・精製を試みた。その結果、酵母発現系より高純度のヒトTREK1 (1-323 aa) が精製できた。・TREK-1チャネルの活性評価：精製チャネルタンパク質の活性評価は、当研究室が開発した液滴接触二重膜法（Contact Babble Bilayer法; CBB法）で行う。まず、CBB法での活性評価系の構築のためTREK1と同じK2PであるヒトTRAAKを用いている。酵母発現系より精製したヒトTRAAKを脂質二重膜に再構成し、CBB法で解析したところ、これまでの報告通り、カリウムイオン選択性を示した。またTREK1やTRAAKは、膜の張力に応答する機械受容性チャネルとして知られ、CBB法は膜張力を自在に制御できる。CBB法で、ヒトTRAAKの膜張力への応答性を解析すると、張力の変化とチャネル活性に相関関係がみられた。したがって、CBB法は精製したヒトTREK1の活性評価も可能であると推定される。

Make sure that you use the TREK-1 information system to make sure that this time you use the following information: this time, you will use the following information: this time, you will use the TREK-1, the reason for this, and the cause of the disease. The new yeast has been introduced into the necessary yeast. The TREK1 activation test is very sensitive. This year, the yeast system is used. This year, the TREK1 system is designed to improve the accuracy of the test. The whole length of TREK1 (1-411 aa) was detected by fusion of yeast and GFP, and the presumptive effect was detected by cell membrane assay and TREK1 fusion. The second, yeast, yeast and TREK1. The reference circuit was established by means of TREK1 crystal analysis. The extracellular domain of the C-terminal terminal was not detected. The TREK1 (1-323 aa) was successfully tested. The results showed that the yeast strain was highly sensitive TREK1 (1-323 aa). TREK-1 was used to determine the activity of liquid droplet contact double membrane method (Contact Babble Bilayer method; CBB method). The activity of CBB method is the same as that of K2P method and CBB method. The activity of TREK1 is the same as that of K2P. The activity of CBB is similar to that of K2P. Yeast was used to refine the TRAAK lipid double membrane, CBB method was used to analyze the lipid double membrane, the report was reported, and the optional information was selected. The TREK1 TRAAK, the membrane force response, the mechanical capacitance test, the control mechanism, the CBB method, the membrane force, the control force, the mechanical capacitance, the membrane force, the membrane force, the membrane force, The CBB method, the TRAAK membrane, the analytical method, the chemical phase, the active phase. It is possible that the activity of TREK1 may be presumed by the method of CBB.