TREK-1に対する鎮痛薬の作用機序解明

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・TREK-1チャネル発現系の確立：今回用いるTREK-1は、ヒト由来のチャネルであり、大腸菌では発現しない。そのため、新たに酵母発現系を導入する必要がある。TREK1を活性化する薬物のスクリーニングに向け、本年度は酵母発現系を用いて、ヒトTREK1タンパク質の発現・精製法の構築を試みた。まず、GFP融合タンパク質としてヒトTREK1全長 (1-411 aa) を酵母に発現させたところ、細胞膜に局在したことから、ヒトTREK1は酵母内で機能体として発現すると推定した。次に、酵母を破砕し、アフィニティー精製を行ったが、TREK1の分解産物が多く十分な純度のタンパク質が得られなかった。そこで、機能ドメインを有するマウスTREK1の結晶構造を参考に、C末端側の細胞膜外領域を欠損させたヒトTREK1（1-323 aa）の発現・精製を試みた。その結果、酵母発現系より高純度のヒトTREK1 (1-323 aa) が精製できた。・TREK-1チャネルの活性評価：精製チャネルタンパク質の活性評価は、当研究室が開発した液滴接触二重膜法（Contact Babble Bilayer法; CBB法）で行う。まず、CBB法での活性評価系の構築のためTREK1と同じK2PであるヒトTRAAKを用いている。酵母発現系より精製したヒトTRAAKを脂質二重膜に再構成し、CBB法で解析したところ、これまでの報告通り、カリウムイオン選択性を示した。またTREK1やTRAAKは、膜の張力に応答する機械受容性チャネルとして知られ、CBB法は膜張力を自在に制御できる。CBB法で、ヒトTRAAKの膜張力への応答性を解析すると、張力の変化とチャネル活性に相関関係がみられた。したがって、CBB法は精製したヒトTREK1の活性評価も可能であると推定される。