NFATc4に焦点を当てた膠芽腫の壊死周囲微小環境の腫瘍幹細胞誘導能解析

以NFATc4为中心分析胶质母细胞瘤坏死周围微环境的肿瘤干细胞诱导能力

基本信息

批准号：
21K09152
负责人：
崔丹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09152/
关键词：
膠芽腫腫瘍幹細胞低酸素低栄養

项目摘要

膠芽腫は極めて予後不良な脳腫瘍であり、病態解明および根治できる治療法の開発は急務である。膠芽腫の治療抵抗性や再発の原因には腫瘍幹細胞がある。これまで我々は、膠芽腫の予後不良を規定する腫瘍細胞として、HIF-1α を発現するとともに幹細胞性質を示し静止期にある腫瘍細胞〔HIF-1α+ Sox2+/Nanog+ RNApIIS2P-/low（以下、H+S+/N+R-/low 細胞）〕（Sox2 およびNanog は幹細胞マーカー、RNApIIS2P は増殖期マーカー）を特定し、この細胞が低栄養・低酸素状態を特徴とする壊死周囲ニッチに特異的に存在することを明らかにした。また、ヒト膠芽腫細胞株U87を用い、「壊死周囲ニッチ」を模したスフェロイド（３次元）培養系において、上記のH+S+/N+R-/low 細胞が出現することを再現し、これらH+S+/N+R-/low細胞の一部にはNFATc4の共発現を伴っていることが示された。「壊死周囲ニッチ」に出現する膠芽腫の予後不良を規定するH+S+/N+R-/low細胞の誘導にNFATc4が関わることが、スフェロイド培養系において示唆された。令和4年度は、ヒト膠芽腫細胞株U87を用いて、ヌードマウス脳に移植し、可視化できる実験系を作成した。方法として、まず、ヒト膠芽腫細胞株U87株にBLIV-MSCV-Luciferrase-EF1a-copGFP-T2A-Puro(BLIV2.0:Plasmid) を導入し、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパクGFP(Luciferrase-GFP)を安定的に発現する細胞を樹立する。その後、Luciferrase-GFPを強制発現したヒト膠芽腫由来細胞株U87を平面培養（2次元）し、様々な個数の細胞をヌードマウス脳に移植し、IVIS Imaging Systemで経時的にモニターする。その結果、2.8x105個以上の細胞を移植すれば腫瘍が形成した。また、移植後の１日目から腫瘍を摘出した28日までIVIS Imaging Systemでモニターできることを明らかにした。さらに、Luciferrase-GFPを強制発現したU87でスフェロイドを作製し、ヌードマウス皮下に移植することも成功した。

胶质母细胞瘤是一种脑肿瘤，预后较差，迫切需要澄清病理并产生治疗性治疗。肿瘤干细胞是胶质母细胞瘤的治疗性耐药性和复发的原因。 So far, we have identified tumor cells that express HIF-1α and exhibit stem cell properties, which are in the quiescent stage (HIF-1α+ Sox2+/Nanog+ RNApIIS2P-/low (hereafter, H+S+/N+R-/low cells)] (Sox2 and Nanog are stem cell markers, RNApIIS2P is a proliferation marker) as tumor cells that define poor prognosis in胶质母细胞瘤，并揭示了这些细胞的特异性存在于营养低和缺氧的特征。 H+S+/N+R-/低细胞伴随着NFATC4的共表达。可以植入裸鼠的大脑并将其视为一种方法，首先将BLIV-MSCV-Luciferrase-ef1a-copGFP-T2A-PURO（BLIV2.0：质粒）引入到人类胶质母细胞瘤细胞系U87中培养的线路（2D）被强制表达，并将各种数量的细胞植入裸小鼠的大脑中，并使用IVIS成像系统进行监测，当肿瘤被植入时，肿瘤也会被植入2.8x105。使用强烈表达的荧光素酶-GFP产生球体，并皮下植入裸鼠。