新たなDNAメチル化解析技術の応用による高精度体液特異的ジェノタイピング法の確立

应用新型DNA甲基化分析技术建立高精度体液特异性基因分型方法

• 批准号: 21K10539
• 负责人: 渡邊 賢
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Research Institute of Police Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K10539/
• 关键词: 物体検査; 人体液斑の同定; DNAメチル化; DNA多型

唾液特異的（脱）メチル化CpG-SNP領域について、既報の3領域（Watanabe et al., Forensic Science International:Genetics, 2022)に加えて、新たに同定した19領域の候補領域を加えた、NGSを用いたバイサルファイトシークエンスによるマルチプレックス同時検出系の確立を試みた。まず、各領域における複数のCpGとその近傍に位置するSNPを増幅するように、バイサルファイトPCR用のプライマーを設計した。コントロールDNAを用いて、各領域についてシングルプレックスPCRをおこない、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、15領域で増幅が確認された。この15領域について、コントロールDNAからマルチプレックスPCRを行い、NGSで解析を行ったところ、ほぼすべての領域において増幅が確認された。一方で、増幅バランスの偏りが著しく、リード数として領域間で最大1000倍程度の違いが見られた。各プライマー濃度を調整し、様々な条件検討を行ったものの、増幅バランスについて著しい改善は認められなかった。したがって、これらのマルチプレックス化により増幅が困難となった領域については、別の増幅系を構築する必要があるものと考えられた。また、膣液特異的（脱）メチル化CpG-SNP領域についても、高度マルチプレックス解析系を確立するため、これまでに実施した各体液試料の網羅的メチル化解析データ（Watanabe et al.,Forensic Science International:Genetics, 2022)をもとに、新たな候補領域の探索を行った。

对于唾液特异性（DE）甲基化的CpG-SNP区域，我们尝试使用使用NGS的甲硫酸盐测序建立同时检测系统，并结合了三个先前报道的区域（Watanabe等人，Forensic Sc​​ience International：Genetics International：Genetics，2022），以及19个新身份的候选人区域。首先，设计了亚硫酸盐PCR的引物，以扩增每个区域的多个CPG，并在附近的SNP中放大多个CPG。使用对照DNA对每个区域进行单质PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳，并在15个区域确认扩增。这15个区域是从对照DNA的多路复用PCR并使用NGS分析，并且在几乎所有区域都证实了扩增。另一方面，放大余额显着偏见，在发现的读数数量中，区域之间的最大差异为1000倍。尽管调整了每个底漆的浓度并检查了各种条件，但没有观察到放大平衡的显着改善。因此，人们认为，由于这些多路复用，需要在很难放大的区域中构建不同的扩增系统。此外，为了建立一个高度的多重分析系统，用于阴道流体特异性（DE）甲基化的CpG-SNP区域，根据每个体液样品的全面甲基化分析数据，搜索了新的候选区域（Watanabe等，Forensic Sc​​ience International：Genetics，2022）。

项目成果

リアルタイムPCRによるDNAメチル化を指標とした 唾液検査法の開発

使用实时PCR开发以DNA甲基化为指标的唾液检测方法

• 发表时间: 2022
• 作者: 渡邊 賢;山岸 孝幸;豊間根 耕地;阿久津 智子
• 通讯作者: 阿久津 智子