新たなDNAメチル化解析技術の応用による高精度体液特異的ジェノタイピング法の確立

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唾液特異的（脱）メチル化CpG-SNP領域について、既報の3領域（Watanabe et al., Forensic Science International:Genetics, 2022)に加えて、新たに同定した19領域の候補領域を加えた、NGSを用いたバイサルファイトシークエンスによるマルチプレックス同時検出系の確立を試みた。まず、各領域における複数のCpGとその近傍に位置するSNPを増幅するように、バイサルファイトPCR用のプライマーを設計した。コントロールDNAを用いて、各領域についてシングルプレックスPCRをおこない、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、15領域で増幅が確認された。この15領域について、コントロールDNAからマルチプレックスPCRを行い、NGSで解析を行ったところ、ほぼすべての領域において増幅が確認された。一方で、増幅バランスの偏りが著しく、リード数として領域間で最大1000倍程度の違いが見られた。各プライマー濃度を調整し、様々な条件検討を行ったものの、増幅バランスについて著しい改善は認められなかった。したがって、これらのマルチプレックス化により増幅が困難となった領域については、別の増幅系を構築する必要があるものと考えられた。また、膣液特異的（脱）メチル化CpG-SNP領域についても、高度マルチプレックス解析系を確立するため、これまでに実施した各体液試料の網羅的メチル化解析データ（Watanabe et al.,Forensic Science International:Genetics, 2022)をもとに、新たな候補領域の探索を行った。