中高齢期から始まるタンパク質品質管理システムの破綻に関する研究

タンパク質品質管理システムの異常は、タンパク質の異常化体の蓄積をもたらし、多くの細胞機能を急速に悪化させる要因のひとつである。本研究はタンパク質品質管理システムに関わるプロテアソーム自身の加齢に伴う異常の原因を明らかにすることを目的としている。本年度は、研究実施計画の（研究１）の「加齢に伴うC2サブユニットの変化」を若齢、中齢および老齢のラット肝臓を用いて調べた。等電点イムノブロット解析の結果、C2サブユニットの等電点は若齢から中齢期までは変化しないが、老齢期では複数の等電点の異なるものが現れることを明らかにした。しかし、N3、C7、C9サブユニットには加齢変化が認められなかった。次に、老齢ラット肝臓のプロテアソームC2サブユニットの翻訳後修飾（研究2）とプロテアソームの安定性（研究3）を調べるためには精製したプロテアソームが必要である。そこで昨年、ウサギに免疫して作成したC2サブユニットポリクローナル抗体を血清から精製し、C2抗体カラムを作成した。この抗体カラムを使用し、次年度は、加齢で現れる翻訳後修飾の解析を進めることにする。なお、解析ターゲットは、これまでの解析結果に基づき、C2サブユニットとし、質量分析による翻訳後修飾プロファイリング解析を進めるのと並行して、既知の異常翻訳修飾体（カルボニル化、AGE化、NO化、Met残基やCys残基の酸化など）の解析を特異的化学反応や特異抗体により解析する。さらに、老若ラット肝臓由来の精製プロテアソームに対するプロテアーゼに対する感受性や熱力学的な安定性を調べ、加齢に伴う異常プロテアソーム蓄積の原因に迫る。

タンパク質品質管理システムの異常は、タンパク質の異常化体の蓄積をもたらし、多くの細胞機能を急速に悪化させる要因のひとつである。本研究はタンパク質品質管理システムに関わるプロテアソーム自身の加齢に伴う異常の原因を明らかにすることを目的としている。本年度は、研究実施計画の（研究１）の「加齢に伴うC2サブユニットの変化」を若齢、中齢および老齢のラット肝臓を用いて調べた。等電点イムノブロット解析の結果、C2サブユニットの等電点は若齢から中齢期までは変化しないが、老齢期では複数の等電点の異なるものが現れることを明らかにした。しかし、N3、C7、C9サブユニットには加齢変化が認められなかった。次に、老齢ラット肝臓のプロテアソームC2サブユニットの翻訳後修飾（研究2）とプロテアソームの安定性（研究3）を調べるためには精製したプロテアソームが必要である。そこで昨年、ウサギに免疫して作成したC2サブユニットポリクローナル抗体を血清から精製し、C2抗体カラムを作成した。この抗体カラムを使用し、次年度は、加齢で現れる翻訳後修飾の解析を進めることにする。なお、解析ターゲットは、これまでの解析結果に基づき、C2サブユニットとし、質量分析による翻訳後修飾プロファイリング解析を進めるのと並行して、既知の異常翻訳修飾体（カルボニル化、AGE化、NO化、Met残基やCys残基の酸化など）の解析を特異的化学反応や特異抗体により解析する。さらに、老若ラット肝臓由来の精製プロテアソームに対するプロテアーゼに対する感受性や熱力学的な安定性を調べ、加齢に伴う異常プロテアソーム蓄積の原因に迫る。