蛍光を発しないGFPホモログ（色素タンパク質）を利用した神経科学研究ツールの開発

使用非荧光 GFP 同系物（色素蛋白）开发神经科学研究工具

• 批准号: 20K06867
• 负责人: 笠原 和起
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06867/
• 关键词: 色素タンパク質

イシサンゴやイソギンチャクの仲間が有する色素タンパク質を哺乳類細胞に応用を試みるために、いくつかの色素タンパク質遺伝子を大腸菌を用いて発現させた結果、特に色が濃く、アルデヒドや有機溶媒に強い色素タンパク質として、ハイマツミドリイシAmiCP（濃紺色）を選択することができた。このAmiCP色素タンパク質をマウス脳に子宮内エレクトロポレーションで発現させると、発色のための処置を行わなくてもに通常の白色光下においてマウス脳皮質が紺色に着目した。そこで、Creドライバー依存的にAmiCPが発現するようなマウス個体を作成することを目指した。これまでに世界中で数多くのCreドライバーラインが開発されており、それらと交配させることによって、特定の組織や細胞種をAmiCPで可視化することができるようになる。そのために次のような特徴をもったコンストラクトを作成した。◯AmiCP色素タンパク質遺伝子のコドンをマウスにおける発現に最適化 ◯TetOffシステムを内部に利用して単なるCAGプロモーターよりも強力に発現を誘導できる（Ai140 (Addgeneから入手したAi140(TIT2L-GFP-ICL-tTA2) targeting vectorを改変した） ◯Cre/loxPシステムによってCre依存的にAmiCPが発現する ◯マウスゲノムのセーフハーバーサイトTIGREにゲノム編集技術CRISPR-Cas9システムを利用してノックインできる（そのためにホモロジーアームを約800bpずつ付与した）ノックイン個体を得るために、このDNAコンストラクトとCas9-tracrRNA-gRNA複合体をマウス受精卵前核（378個）に微量注入した。生まれてきた14匹の尻尾DNAを解析したが、残念ながら組換え体は1匹も得られなかった。

イ シ サ ン ゴ や イ ソ ギ ン チ ャ ク の が have between secondary す る pigment タ ン パ ク qualitative を mammalian cells に try を 応 み る た め に, い く つ か の pigment タ ン パ ク qualitative heritage 伝 son を coliform を with い て 発 now さ せ た results, に が thick く, ア ル デ ヒ ド や strong organic solvent に い pigment タ ン パ ク qualitative と し て, ハ イ マ ツ ミ ド リ イ シ AmiCP (Dark blue) を choose 択する とがで とがで た. こ の AmiCP pigment タ ン パ ク qualitative を マ ウ ス 脳 に uterus エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン で 発 now さ せ る と, 発 の た め の 処 line buy を わ な く て も に usually の densities under に お い て マ ウ ス 脳 cortex が GanSe に with mesh し た. そ こ で, Cre ド ラ イ バ ー dependent に AmiCP が 発 now す る よ う な マ ウ ス individual を made す る こ と を refers し た. こ れ ま で に world で more く の Cre ド ラ イ バ ー ラ イ ン が open 発 さ れ て お り, そ れ ら と mating さ せ る こ と に よ っ て, specific の tissue や cells を AmiCP で visualization す る こ と が で き る よ う に な る. Youdaoplaceholder0 そ ために and then <s:1> ような characteristics を ったコ ったコ ストラ ストラ トを トを are made as た た. ◯ AmiCP pigment タ ン パ ク qualitative heritage 伝 son の コ ド ン を マ ウ ス に お け る 発 now に optimization ◯ TetOff シ ス テ ム を internal に using し て 単 な る the CAG プ ロ モ ー タ ー よ り も powerful に 発 now を induced で き る (Ai140 (Addgene か ら of し た Ai140 (TIT2L - GFP - ICL - tTA2) targeting vector を change - し た) ◯ Cre/loxP シ ス テ ム に よ っ て Cre dependent に AmiCP が 発 now す る ◯ マ ウ ス ゲ ノ ム の セ ー フ ハ ー バ ー サ イ ト TIGRE に ゲ ノ ム CRISPR compiling technology - Cas9 シ ス テ ム を using し て ノ ッ ク イ ン で き る (そ の た め に ホ モ ロ ジ ー ア ー ム を about 800 bp ず つ give し た) ノ ッ ク イ ン individual を must る た め に, こ の DNA コ ン ス ト ラ ク ト と Cas9 - t racrRNA-gRNA complex を ウス ウス the prenucleus of the fertilized egg (378) に microinjection た. The DNA of 14 samples of the tail of the gudi is を analyzed. The <s:1> たが and the ながら groups of the remnant are replaced with え bodies た and 1 sample of gives られな た った った.