蛍光を発しないGFPホモログ（色素タンパク質）を利用した神経科学研究ツールの開発

使用非荧光 GFP 同系物（色素蛋白）开发神经科学研究工具

基本信息

批准号：
20K06867
负责人：
笠原和起
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06867/
关键词：
色素タンパク質

项目摘要

イシサンゴやイソギンチャクの仲間が有する色素タンパク質を哺乳類細胞に応用を試みるために、いくつかの色素タンパク質遺伝子を大腸菌を用いて発現させた結果、特に色が濃く、アルデヒドや有機溶媒に強い色素タンパク質として、ハイマツミドリイシAmiCP（濃紺色）を選択することができた。このAmiCP色素タンパク質をマウス脳に子宮内エレクトロポレーションで発現させると、発色のための処置を行わなくてもに通常の白色光下においてマウス脳皮質が紺色に着目した。そこで、Creドライバー依存的にAmiCPが発現するようなマウス個体を作成することを目指した。これまでに世界中で数多くのCreドライバーラインが開発されており、それらと交配させることによって、特定の組織や細胞種をAmiCPで可視化することができるようになる。そのために次のような特徴をもったコンストラクトを作成した。◯AmiCP色素タンパク質遺伝子のコドンをマウスにおける発現に最適化 ◯TetOffシステムを内部に利用して単なるCAGプロモーターよりも強力に発現を誘導できる（Ai140 (Addgeneから入手したAi140(TIT2L-GFP-ICL-tTA2) targeting vectorを改変した） ◯Cre/loxPシステムによってCre依存的にAmiCPが発現する ◯マウスゲノムのセーフハーバーサイトTIGREにゲノム編集技術CRISPR-Cas9システムを利用してノックインできる（そのためにホモロジーアームを約800bpずつ付与した）ノックイン個体を得るために、このDNAコンストラクトとCas9-tracrRNA-gRNA複合体をマウス受精卵前核（378個）に微量注入した。生まれてきた14匹の尻尾DNAを解析したが、残念ながら組換え体は1匹も得られなかった。

为了尝试将珊瑚和海葵家族拥有的色素蛋白应用于哺乳动物细胞，使用大肠杆菌表达了几种色素蛋白基因，作为一种特别深色的色素蛋白，我们能够选择AMICP（深蓝色）作为一种尤其是深色和对Aldehydehyde的色素蛋白。当这种Amicp色素蛋白通过宫内电穿孔在小鼠大脑中表达时，小鼠脑皮层在正常的白光下集中在海军蓝色上，而无需接受颜色发育的治疗。因此，我们旨在创建以CRE驱动器依赖性方式表达AMICP的小鼠个体。迄今为止，在世界各地已经开发了许多CRE驱动线，并且通过将特定的组织和细胞类型交配，可以使用AMICP可视化。为此，我们创建了一个具有以下特征的构造：◯优化小鼠表达的AMICP铬素蛋白基因的密码子与简单的CAG启动子（AI140（AI140）（ai140（tit2l-gfp-iCl-tta2）靶向AM AM AM AMENTIRECTERDEAMERTINDEAMERIDEAMENTIEND AMSERTIEND cRETERIAMERIDECTERIDECTECERAMED AM AM AMCERTIND a adpece indired cartece cag启动器更强烈地诱导表达表达。通过CRE/LOXP系统◯获得可以将其敲入小鼠基因组的安全部位的敲击个体（这就是为什么给出一个同源的臂每个分别为800 bp），将DNA构建体和cas9-tracrrna-grna复合物分解为核心的核心卵（378）。