蛍光を発しないGFPホモログ（色素タンパク質）を利用した神経科学研究ツールの開発

使用非荧光 GFP 同系物（色素蛋白）开发神经科学研究工具

• 批准号: 20K06867
• 负责人: 笠原 和起
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06867/
• 关键词: 色素タンパク質

イシサンゴやイソギンチャクの仲間が有する色素タンパク質を哺乳類細胞に応用を試みるために、いくつかの色素タンパク質遺伝子を大腸菌を用いて発現させた結果、特に色が濃く、アルデヒドや有機溶媒に強い色素タンパク質として、ハイマツミドリイシAmiCP（濃紺色）を選択することができた。このAmiCP色素タンパク質をマウス脳に子宮内エレクトロポレーションで発現させると、発色のための処置を行わなくてもに通常の白色光下においてマウス脳皮質が紺色に着目した。そこで、Creドライバー依存的にAmiCPが発現するようなマウス個体を作成することを目指した。これまでに世界中で数多くのCreドライバーラインが開発されており、それらと交配させることによって、特定の組織や細胞種をAmiCPで可視化することができるようになる。そのために次のような特徴をもったコンストラクトを作成した。◯AmiCP色素タンパク質遺伝子のコドンをマウスにおける発現に最適化 ◯TetOffシステムを内部に利用して単なるCAGプロモーターよりも強力に発現を誘導できる（Ai140 (Addgeneから入手したAi140(TIT2L-GFP-ICL-tTA2) targeting vectorを改変した） ◯Cre/loxPシステムによってCre依存的にAmiCPが発現する ◯マウスゲノムのセーフハーバーサイトTIGREにゲノム編集技術CRISPR-Cas9システムを利用してノックインできる（そのためにホモロジーアームを約800bpずつ付与した）ノックイン個体を得るために、このDNAコンストラクトとCas9-tracrRNA-gRNA複合体をマウス受精卵前核（378個）に微量注入した。生まれてきた14匹の尻尾DNAを解析したが、残念ながら組換え体は1匹も得られなかった。

The results showed that the pigment concentration, pigment concentration and organic solvent concentration were higher than those of the pigment concentration and organic solvent concentration. AmiCP pigment is produced in utero and treated in normal white light. Cre de la Ville is an AmiCP. There are a number of species in the world that can be visualized in AmiCP, including specific tissues and cell species. The first step is to make a decision. AmiCP Pigment Pigment: A New Approach to the Development of AmiCP Pigment: A New Approach to the Development of AmiCP Pigment Pigment （Ai140 (Add gene to Ai140(TIT2L-GFP-ICL-tTA2) targeting vector change) Cre/loxP system to Cre dependent AmiCP system to produce Cre dependent AmiCP system to produce Cre/loxP system to produce Cre dependent AmiCP system to CRISPR system. Cas9-tracrRNA-gRNA complex was injected into the pre-nucleus of fertilized eggs (378) by microinjection into the pre-nucleus of fertilized eggs. The DNA of the 14-piece tail was analyzed and the DNA of the 14-piece tail was analyzed