第三の酸化還元補酵素を利用する新規酵素の同定と機能解析

利用第三种氧化还原辅酶的新型酶的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
14780499
负责人：
笠原和起
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ピロロキノリンキノン(PQQ)は、ニコチンアミド(NADなど)およびフラビン(FADなど)に次ぐ第三の酸化還元補酵素としてバクテリアにおいて見つかったが、その後、多くの食物にPQQが含まれていることが判明した。また、PQQを含まない餌を与えたマウスは発達不良をはじめとする多くの異常を示したことから、PQQは哺乳類にとって重要な栄養素のひとつではないかと考えられた。しかし、生体内の役割については謎に包まれていた。我々は、PQQ結合モチーフを持ったタンパク質をコードする新規遺伝子を哺乳類から見出した。マウスのこのタンパク質はリジン代謝に関わる酵素であるアミノアジピン酸マミアルデヒド(AAS)脱水素酵素であろうと推測された。昨年度までに、ノザンブロット解析などの基本的なデータを取得した。その後、マウスの摂餌状態によってこの遺伝子の発現が変化することや、PQQを含まない餌を与えたマウスにおいて末梢血液中におけるリジンの代謝産物の量に変化が起きていることを確認した。これらの結果から、PQQは新規の酸化還元補酵素であると考えられた。そして、この我々の成果と、すでに報告されていた栄養学的なデータを併せて考慮すると、PQQは哺乳類(少なくともマウス)にとって新規のビタミンであることが強く示唆された。今年度はさらに、バキュロウィルス-昆虫細胞系を用い、AAS脱水素酵素を発現させ、その機能を解析した。これまでに、ATP依存的に基質と結合することを見出した。また、この研究の過程で、AAS脱水素酵素が極めて珍しい翻訳後修飾(4'-ホスホパンテテイン化)を受けることが判明した。そこで、その翻訳後修飾を担う酵素のクローニングした。この酵素を発現・精製し、試験管内において、リコンビナントAAS脱水素酵素4'-ホスホパンテテイン化させることにも成功した。

在细菌中发现了吡咯喹啉酮（PQQ），是烟酰胺（例如NAD）和黄素（例如FAD）之后的第三个氧化还原酶辅酶，但此后已发现它在许多食物中都包含PQQ。此外，喂食不含PQQ的食物的小鼠表现出许多异常，包括发育不良，这表明PQQ是哺乳动物的重要营养素之一。但是，在身体中的角色被神秘笼罩。我们发现了来自编码携带PQQ结合基序的蛋白质的哺乳动物的新基因。据推测，该蛋白在小鼠中是氨基磷酸丙二醇甲醛（AAS）脱氢酶，一种参与赖氨酸代谢的酶。到去年，已经获得了基本数据，例如Northern印迹分析。然后证实，该基因的表达因小鼠的喂养状态而改变，并且在喂食不包含PQQ的食物的小鼠外周血中的赖氨酸代谢产物量发生了变化。这些结果表明PQQ是一种新型的氧化还原酶辅酶。此外，考虑到我们的结果以及已经报道的营养数据，强烈建议PQQ是哺乳动物（至少小鼠）的新型维生素。今年，我们还使用细菌病毒诱导细胞系来表达AAS脱氢酶并分析其功能。到目前为止，已经发现它以ATP依赖性方式与底物结合。此外，在这项研究过程中，发现AAS脱氢酶经历了极为罕见的翻译后修饰（4'-磷酸耐受）。因此，克隆了负责翻译后修饰的酶。该酶被表达和纯化，并在试管中成功转化为重组AAS脱氢酶4'-磷酸乙烯素。