Bcl6の肝臓特異的転写制御ネットワークの解明とNASH創薬への応用

Bcl6 肝脏特异性转录调控网络的阐明及其在 NASH 药物发现中的应用

• 批准号: 20K08394
• 负责人: 近田 裕美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08394/
• 关键词: Bcl6; Bcl6相互作用因子群; NASH; B cell lymphoma 6; 転写制御ネットワーク; 肝臓; 非アルコール性脂肪性肝炎NASH

我々は、科研費特別研究員奨励費による研究の成果として、Bcl6が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）発症に関与することを肝臓特異的欠損マウスを用いて証明した。Bcl6の分子機能については、B細胞等の免疫細胞ではBCoR等と複合体を形成し、抑制性の転写因子として機能することが報告されている。一方で、肝臓におけるBcl6の分子機能に関する報告はほとんどない。本研究では、肝臓でのBcl6の分子機能を明らかにし、NASH発症メカニズムの解明・Bcl6およびその下流シグナルをターゲットにしたNASH治療薬の創薬を目的とする。そこで、アデノ随伴ウィルス（AAV）による個体肝臓での遺伝子発現系を用いて、肝臓特異的なBcl6相互作用因子群を精製・同定し、機能解析を行う予定であったが、研究代表者の身分変更に伴い、中途終了となった。予備的な検討において、Bcl6を過剰発現した個体肝臓は軽度の脂肪肝が誘導されており、この脂肪肝から比重遠心法で肝細胞を単離するのは困難であることが分かった。そこで、新たな肝臓の核単離方法として、スクロース濃度と遠心を利用する方法を検討した。この結果、健常肝臓および脂肪肝の両方で核を単離することに成功した。次にこの方法を用いて、AAV-ControlおよびAAV-hBcl6-FLAGをオスマウスに腹腔内投与した3日後の肝臓から核を単離し、核タンパク質を抽出した。この核タンパク質を用いて、Anti-FLAG M2 agarose affinity gelを用いた免疫沈降およびFLAGペプチドによる溶出を行い、Bcl6相互作用因子群を精製した。この精製サンプルに対して、質量分析測定を行い、Bcl6相互作用因子群を同定したが、細胞質由来と考えられるタンパク質が多く検出され、核由来のBcl6に特異的な相互作用因子群を見出すのが困難であった。このことから、核タンパク質抽出方法を改良する必要があると考えられた。

The results of our research and the use of Bcl-6 in the development of NASH have been demonstrated. Bcl-6 has been reported to function as an inhibitory factor in the formation of BCoR complexes in immune cells such as B cells. A report on the molecular function of Bcl-6 in liver and liver tissues was published. This study aims to clarify the molecular function of Bcl-6 in liver and kidney, and to clarify the molecular function of Bcl-6 in NASH and its downstream. The gene expression system of individual liver samples was refined, identified, and functionally analyzed according to the identity of the study representative. In preparation for this study, Bcl-6 expression was detected in individual liver tissues and fatty liver tissues. It was difficult to isolate liver cells from fatty liver tissues. A new method of nuclear separation is discussed. The results of this study were as follows: In addition, AAV-Control and AAV-hBcl-6-FLAG were used to extract the nuclear protein from the liver 3 days after intraperitoneal injection. Anti-FLAG M2 agarose affinity gel is used to purify Bcl6 interacting factors. The purification, quality analysis, identification of Bcl-6 interacting factor groups, cytoplasmic origin, quality, and nuclear origin of Bcl-6 interacting factor groups are difficult to identify. It is necessary to improve the quality extraction method.