心内膜心筋生検試料のプロテオーム解析手法の確立と応用

心内膜心肌活检样本蛋白质组分析方法的建立及应用

基本信息

批准号：
20K08485
负责人：
若林真樹
金额：
$ 2.83万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08485/
关键词：
プロテオミクス心内膜心筋生検 FFPE OCT LC-MS 翻訳後修飾解析

项目摘要

基礎研究に利用可能なヒト心筋生検組織は非常に稀少で、入手は非常に困難である。そこで前年度までに解析手法を確立してきたホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織に加えてOCT包埋組織へもプロテオーム解析手法を適用可能とすることで、解析可能な心筋生検組織の入手可能性が高くなることを期待し、本年度はOCT包埋心筋組織を用いて効率よくプロテオーム解析を行う手法の確立を試みた。まず、OCT包埋マウス心筋組織から切り出した薄切切片に対して尿素・グアニジン・PTS法などを用いた通常の前処理手法（PTS法）を適用したところ、新鮮凍結組織の場合と比較してタンパク質の抽出・還元アルキル化・消化の効率が低下することが分かった。OCTコンパウンドは親水性で容易に除去可能と推測されたが、実際にはサイズ排除や逆相カラム等の手法を用いて除去する必要があった。また、薄切切片のように極微量の試料の場合には除去後に固相カラム上でそのまま前処理を完了することで、試料のロスを減らし、新鮮凍結組織と同様のデータを取得可能なことが分かった。本年度中にヒト臨床試料への応用を計画していたが、試料の入手が困難であったため、来年度に実試料が入手可能となり次第、実試料の分析を進める予定である。また、前年度までに開発したキャピラリーカラムを用いた前処理手法の再現性を向上するため、再現性の高いカラム作製手法の調整を行った。レーザープラーを用いたスプレーカラムの作製条件を１条件に最適化し、nanoLCシステムを用いて等圧負荷をかけてカラムの充填を行うことで、再現性良く分離用、分析用のキャピラリーカラムを作製可能な条件を確立した。

可用于基础研究的人体心肌活检组织极为罕见，难以获得。因此，希望通过使蛋白质组分析方法能够应用于OCT填充的组织外，除了福尔马林固定的石蜡包裹（FFPE）组织，直到上一年才建立了可以分析的心肌生物检查组织的可用性。今年，我们试图建立一种使用OCT夹紧的心肌组织有效蛋白质组分析的方法。首先，当将常规预处理方法（PTS方法）应用于使用尿素，鸟嘌呤，PTS方法等从OCT填充的小鼠心肌组织切割的薄切片时，发现蛋白质提取的效率，降低烷基化和消化的效率与新鲜的液化组织相比会降低。据推测，OCT化合物是亲水性的，可以轻松去除，但实际上，有必要使用尺寸排除或反向相列等技术将其删除。此外，发现在较薄的部分（例如薄部分）的情况下，去除后在固相柱上完成了预处理，可以获得可以获得样品丢失和与新鲜冷冻组织相似的数据。尽管该公司计划在今年将其应用于人类的临床样本，但很难获得样品，因此，一旦实际样品明年可用，对实际样品的分析就会进行。此外，为了使用前一年开发的毛细管柱提高预处理方法的可重复性，调整了高度可重现的柱制造方法。使用激光拉杆的喷雾柱的制备条件被优化为一个条件，并在等静力负载下使用纳米克系统填充柱，从而使毛细管柱进行毛细管柱进行分离和分析，并具有良好的可重复性。