活性化プロテインCおよびプロテインS制御による安定化第VIII因子製剤の開発

通过控制活化蛋白C和蛋白S开发稳定因子VIII制剂

• 批准号: 20K08760
• 负责人: 武山 雅博
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08760/
• 关键词: 第VIII因子; 活性化プロテインC; 活性型プロテインC; プロテインS; 血友病

本研究の目的は、FVIIIを中心とした凝固・抗凝固機能のさらなる解明と、抗凝固機能を受けにくい変異FVIIIを作成することにより、安定型・長時間作用型 FVIII製剤へ応用することである。我々が目指す新規FVIII製剤は、活性化プロテインC(APC)/プロテインS(PS)の結合部位を変異させた全く新たな機序による製剤 である。新規FVIII製剤はAPC/PSと の結合能が弱く、APC/PSにより不活化されにくいため、従来のFVIII製剤より安定性が高く、長時間作用すると考えられる。 これまでに、FVIII上のAPC結合部位 の詳細な同定を行い、APCがFVIII軽鎖(A3ドメイン)アミノ酸残基2007-2016に結合することを示した。これらの研究をもとに、FVIII重鎖(A2ドメイ ン)上の新規APC結合部位の同定について研究を行った。SPR-assayにより、DEGR-APCと400-429ペプチドが結合し、同領域がAPCの結合部位であることが示唆された。FVIIIはAPCにより開裂を受け、不活化されるが、その不活化が420-429ペプ チドの存在により阻害されるかを検討した。420-429ペプチド存在下ではFVIIIのAPCによる不活化は、420-429ペプチド非存在下と比べて低下しており、420-429ペプチドがAPCの 作用を阻害することを示した。さらに、APCと420-429ペプチドが、EDC クロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することが明らかになった。さらに、western blottingによ りAPCと420-429ペプチドをEDCクロスリンカーさせたbandを、アミノ酸シークエンスすることを試みたが、得られたバンドが非常に薄く、アミノ酸シーケンスを断念した。

The purpose of this study is to clarify the coagulation and anti-coagulation functions of FVIII, and to establish stable and long-acting FVIII. We refer to the new FVIII system, activation of the C(APC)/S(PS) binding sites, and the new mechanism of the system. The new FVIII system has weak APC/PS binding energy, inactive APC/PS binding energy, high stability and long duration of action. The APC binding site on FVIII is identified in detail in this section. APC binds to FVIII residues 2007-2016. The new APC binding site on FVIII re-lock (A2) was identified and studied. SPR-assay, DEGR-APC, 400-429, and APC binding sites in the same field. FVIII APC is open, inactive, and inactive. 420-429. 420-429 Inactivation of APC in FVIII in the Presence of a Defender 420 - 429 Inhibition of APC in FVIII in the Presence of a Defender The APC 420-429 is a direct connection between the APC 420 -429 and the EDC 420-429. The APC 420-429 is the best choice.