活性化プロテインCおよびプロテインS制御による安定化第VIII因子製剤の開発

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本研究の目的は、FVIIIを中心とした凝固・抗凝固機能のさらなる解明と、抗凝固機能を受けにくい変異FVIIIを作成することにより、安定型・長時間作用型 FVIII製剤へ応用することである。我々が目指す新規FVIII製剤は、活性化プロテインC(APC)/プロテインS(PS)の結合部位を変異させた全く新たな機序による製剤 である。新規FVIII製剤はAPC/PSと の結合能が弱く、APC/PSにより不活化されにくいため、従来のFVIII製剤より安定性が高く、長時間作用すると考えられる。 これまでに、FVIII上のAPC結合部位 の詳細な同定を行い、APCがFVIII軽鎖(A3ドメイン)アミノ酸残基2007-2016に結合することを示した。これらの研究をもとに、FVIII重鎖(A2ドメイ ン)上の新規APC結合部位の同定について研究を行った。SPR-assayにより、DEGR-APCと400-429ペプチドが結合し、同領域がAPCの結合部位であることが示唆された。FVIIIはAPCにより開裂を受け、不活化されるが、その不活化が420-429ペプ チドの存在により阻害されるかを検討した。420-429ペプチド存在下ではFVIIIのAPCによる不活化は、420-429ペプチド非存在下と比べて低下しており、420-429ペプチドがAPCの 作用を阻害することを示した。さらに、APCと420-429ペプチドが、EDC クロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することが明らかになった。さらに、western blottingによ りAPCと420-429ペプチドをEDCクロスリンカーさせたbandを、アミノ酸シークエンスすることを試みたが、得られたバンドが非常に薄く、アミノ酸シーケンスを断念した。