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IgEの架橋活性を指標とする新規セルフリーアレルギー試験法の開発

以IgE交联活性为指标开发新的无细胞过敏测试方法

基本信息

批准号：
20K08782
负责人：
秋山晴代
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Teikyo Heisei University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08782/
关键词：
EXiLE法架橋 FcεRI セルフリー IgE

项目摘要

アレルギー試験法EXiLE法は、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現させた培養マスト細胞株を、アレルギー患者血清(IgE)で感作し、抗原添加による細胞の活性化をルシフェラーゼアッセイにより検出する手法で、高感度にIgEの「架橋活性」を評価できる画期的な試験法である。しかし一方で、本法では一部の血清や抗原が細胞障害性を示し正確な測定が出来ない問題に直面している。そこで本研究では、EXiLE法の特徴を活かし、「架橋」を指標とした新しい「セルフリー型」アレルギー試験法の開発を主目的とする。具体的には、ルシフェラーゼ相補性システムを利用して各種発光タグ融合FcεRI α鎖を作製し、セルフリー条件下IgEと抗原結合により導かれるFcεRIの架橋を評価する新しいアレルギー試験系を開発する。昨年度は、T7プロモーターを有しているHaloTag(HT)用ベクターのN末端側とC末端側にFcεRI α－レポーター(NanoBit)配列(4通り)を挿入した遺伝子を作製し、大腸菌抽出液を利用した無細胞系によるタンパク精製を行った。本年度は、収量および純度の高いリコンビナントタンパク質の精製を目指し、検討をおこなった。無細胞系によるタンパク質合成における誘導時間、温度、振とう速度等の条件検討を実施したところ、収量に変化は見られなかった。次に、PEIを用いてHEK293T細胞へのトランスフェクションを行った。しかし目的タンパク質を大量に発現させるまでには至らなかった。セルフリー条件下IgEと抗原結合によるFcεRIの架橋を評価するためには大量のリコンビナントタンパク質が必須であるため、今後、動物細胞によるタンパク質精製に適したベクターを用いた新たな遺伝子の作製や大腸菌を用いたタンパク精製を試みる。

The EXILE method is a method for developing cultured cell lines, detecting the high affinity IgE receptor (FcεRI), and evaluating the "bridging activity" of IgE in serum (IgE) from patients with high affinity IgE receptor (FcεRI). This method can be used to determine the cellular toxicity of some serum antigens. This study aims to explore the characteristics of EXILE method and the development of "bridge" method. Specifically, a novel FCR assay system was developed to evaluate the FcεRI bridging between IgE and antigen binding using a variety of light emitting fusion FcεRI alpha locks. In the past year, HaloTag(HT) was prepared by N-terminal and C-terminal FcεRI α-terminal (NanoBit) alignment (4-channel), and Escherichia coli extract was purified by cell-free system. This year, the quality and purity of the product are high, and the quality of the product is high. There are no cell lines in which the induction time, temperature, vibration speed and other conditions are discussed. The HEK293T cell phone is designed for use with PEI. The goal is to make sure that you have a good time. In the future, animal cells will be used for purification of IgE and FcεRI, and the production and purification of E. coli will be tested.