CCN２の転写因子様機能を介した線維症のキープレイヤー筋線維芽細胞分化機構の解明

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線維症の増悪に関わる筋線維芽細胞は線維芽細胞から分化すると考えられているが、その分化メカニズムは未だ不明である。本研究課題の目的は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化にCellular communication network factor 2 (CCN2)がどの様に関わっているを明らかにすることであり、これまで、核内に移行したCCN2が転写共役因子としてCCN2自体及び筋線維芽細胞分化のmaster regulatorであるPU.1の発現制御に関与する可能性を示した。今回、これらの知見の論文化に向けて、さらに詳細に以下のことを検討した。1.シグナルペプチドを欠失させたCcn2のN末にFlag-Tagを付加したFlag-Ccn2あるいは完全長のCcn2のC末にHA-Tagを付加したCcn2-HAのそれぞれの発現プラスミドをNIH3T3細胞に遺伝子導入した後、細胞質画分と核画分に厳密に分離し、各Tag抗体でWestern blot解析を行った結果、Ccn2-HAを導入した細胞でのみ核画分にシグナルを認めた。2.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞の核画分に抗YAP抗体を加え免疫沈降を行った後、抗HA抗体でWestern blot解析を行うと、HAのバンドが検出され、YAPとCCN2の結合が示唆された。3.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞のゲノムDNAを抽出後、抗CCN2抗体で免疫沈降し、CCN2及びPU.1のプロモーター領域のプライマーを用いてPCRを行った結果、CCN2及びPU.1のプライマーによってDNA断片の増幅が検出された。4.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞の核画分とCcn2プロモーター領域部で作成したDNAプローブによるゲルシフトアッセイによって、核画分タンパク質とDNAプローブとの結合が示された。