質量分析計を用いたRNA-タンパク質間相互作用マッピング法の開発

使用质谱仪开发RNA-蛋白质相互作用作图方法

• 批准号: 20K15313
• 负责人: 八巻 優佳
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K15313/
• 关键词: 質量分析; プロテオミックマッピング; RNA; 転写後修飾; LC-MS

本研究では、ノンコーディングRNA（ncRNA）とタンパク質の相互作用を、質量分析計およびデータベースサーチを用いて網羅的にマッピングする方法を開発する。そのために、まずはヒト培養細胞を用いて標的ncRNAと相互作用するタンパク質の発現・精製システムの構築を目指した。当初の計画では、標的ncRNA近傍のタンパク質をビオチン・リガーゼ変異体であるTurboIDにより触媒する近接依存性標識法を用いる方法を立案した。特徴として、細胞に対する毒性がなく、短時間のビオチンラベリングのため、乖離が早いとされるRNA-タンパク質間相互作用をも明らかにする利点を有する。しかし、これはタンパク質の表面に位置するリジン残基が限定的にビオチン化されるため、ビオチン化がタンパク質のアミノ酸組成により影響を受ける懸念が生じた。そこで本研究では、リジン残基に限らずビオチン化するアスコルビン酸ペルオキシダーゼAPEX2を用いることにした。細胞に導入するncRNAには、バクテリオファージMS2由来の特異配列（タグ）を付加した。一方、APEX2発現ベクターには、同時にMS2 タグを認識し結合するMS2 コートタンパク質（MS2 coat protein, MCP）配列を組み込んだ。これら2つのベクターとビオチンを同時に細胞に導入すると、MS2タグにMCPが結合し、ncRNA近傍のタンパク質がAPEX2によりビオチン化される。これまでに、ヒト胚性腎臓細胞由来HEK293T細胞にベクターを導入し、ウエスタンブロッティングにてAPEX2が発現されることを確認した。また、細胞内のncRNAベクターの転写状況は、定量PCRにより検証した。ベクターを導入した細胞より抽出したRNAを逆転写し、得られたcDNAを鋳型とした定量PCRにより、導入したncRNAが細胞内で転写されることが明らかになった。

在这项研究中，我们将开发一种使用质谱仪和数据库搜索的非编码RNA（NCRNA）的蛋白质相互作用的方法。为此，我们首先旨在构建使用人培养细胞与靶NCRNA相互作用的蛋白质的表达和纯化系统。最初的计划是开发一种使用邻近依赖性标记方法的方法，该方法通过生物素连接酶突变涡轮增压蛋白在靶NCRNA附近催化蛋白质。它的优点是它对细胞无毒，并且是短期生物素标记，这也揭示了RNA - 蛋白质相互作用，据说这是快速差异。然而，这引起了人们的担忧，即生物素化将受到蛋白质的氨基酸组成的影响，因为位于蛋白质表面的赖氨酸残基有限的生物素化。因此，在这项研究中，我们决定使用生物素化的抗坏血酸过氧化物酶Apex2，该抗坏血酸酶Apex2不限于赖氨酸残基。添加引入细胞中的NCRNA，并用源自噬菌体MS2的特定序列（TAG）。另一方面，APEX2表达矢量结合了MS2涂层蛋白（MCP）序列，该序列同时识别并结合了MS2 TAG。当这两个载体和生物素同时引入细胞时，MCP与MS2 TAG结合，而NCRNA附近的蛋白质被APEX2生物素化。到目前为止，将载体引入了来自人类胚胎肾细胞的HEK293T细胞中，Western印迹证实了Apex2的表达。此外，通过定量PCR验证了细胞中NCRNA载体的转录状态。从引入载体的细胞中提取的RNA是逆转录的，使用所获得的cDNA作为模板的定量PCR揭示了引入的NCRNA在细胞内转录。