質量分析計を用いたRNA-タンパク質間相互作用マッピング法の開発

使用质谱仪开发RNA-蛋白质相互作用作图方法

• 批准号: 20K15313
• 负责人: 八巻 優佳
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K15313/
• 关键词: 質量分析; プロテオミックマッピング; RNA; 転写後修飾; LC-MS

本研究では、ノンコーディングRNA（ncRNA）とタンパク質の相互作用を、質量分析計およびデータベースサーチを用いて網羅的にマッピングする方法を開発する。そのために、まずはヒト培養細胞を用いて標的ncRNAと相互作用するタンパク質の発現・精製システムの構築を目指した。当初の計画では、標的ncRNA近傍のタンパク質をビオチン・リガーゼ変異体であるTurboIDにより触媒する近接依存性標識法を用いる方法を立案した。特徴として、細胞に対する毒性がなく、短時間のビオチンラベリングのため、乖離が早いとされるRNA-タンパク質間相互作用をも明らかにする利点を有する。しかし、これはタンパク質の表面に位置するリジン残基が限定的にビオチン化されるため、ビオチン化がタンパク質のアミノ酸組成により影響を受ける懸念が生じた。そこで本研究では、リジン残基に限らずビオチン化するアスコルビン酸ペルオキシダーゼAPEX2を用いることにした。細胞に導入するncRNAには、バクテリオファージMS2由来の特異配列（タグ）を付加した。一方、APEX2発現ベクターには、同時にMS2 タグを認識し結合するMS2 コートタンパク質（MS2 coat protein, MCP）配列を組み込んだ。これら2つのベクターとビオチンを同時に細胞に導入すると、MS2タグにMCPが結合し、ncRNA近傍のタンパク質がAPEX2によりビオチン化される。これまでに、ヒト胚性腎臓細胞由来HEK293T細胞にベクターを導入し、ウエスタンブロッティングにてAPEX2が発現されることを確認した。また、細胞内のncRNAベクターの転写状況は、定量PCRにより検証した。ベクターを導入した細胞より抽出したRNAを逆転写し、得られたcDNAを鋳型とした定量PCRにより、導入したncRNAが細胞内で転写されることが明らかになった。

The purpose of this study is to analyze the interaction between RNA (ncRNA) and the interaction between each other. Quantitative analysis and analysis are used to analyze the performance of the Internet based on the Internet. Use the ncRNA to interact with each other in order to find out the best results. At the beginning, the ncRNA of the project was used to file a case by using the method of filing a case using the method of "TurboID", "catalyst", "proximity dependency tag". Special attention is paid to the toxicity test, short-time response, short-time response, and early detection of the interaction between the RNA- and the atmosphere. The position of the surface, the position, the position, the position In this study, the residue limit was used in this study, and the residue limit was used in this study. The cell is loaded into the ncRNA, and the MS2 comes from the special configuration, the payment plus the price. One party, APEX2, and at the same time, make sure that the MS2 information system is combined with the MS2 information system (MS2 coat protein, MCP) to assign the organization information. In the same time, you need to enter the computer, MS2, MCP, and ncRNA. You need to improve the performance of the APEX2. The cause of the HEK293T cells is the origin of the embryogenic cells. The cells are caused by the cells. The cells are not allowed to enter. The cells are confirmed by the APEX2 cells. NcRNA, intracellular and quantitative PCR were recorded and quantified. The RNA was extracted from the cell, and the quantitative PCR was obtained from the cDNA. The ncRNA was inserted into the cell and the cell was written.