ヘッジホッグ受容体のプロセシングと不安定化を介した新奇発癌抑制機構の解明

阐明由刺猬蛋白受体加工和不稳定介导的新型肿瘤抑制机制

基本信息

批准号：
13J03763
负责人：
八巻優佳
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

これまで私は、ヒトPatched1 (Ptc1) 第7細胞質ドメイン (intracellular domain 7: ICD7) との新規結合タンパク質としてA kinase interacting protein (AKIP1) を同定した。AKIP1はNF-κBファミリー転写因子であるp65の核内保持に関与する報告がある。一方、Sonic hedgehog (Shh)-Ptc1依存的情報伝達経路とAKIP1との関連は全く調べられていない。そこで本研究では、AKIP1によるPtc1 ICD7断片の制御メカニズム解明に向け、Ptc1 ICD7がAKIP1と複合体を形成することに着目した。Shhシグナル伝達経路における最終アウトプットであるGli転写因子の活性測定により、Ptc1 ICD7-AKIP1複合体が果たす役割を明らかにすることを課題とした。Shh応答能を有する間葉系幹細胞において、siRNAによるakip1遺伝子ノックダウン条件下では、コントロールに比べて骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ (ALP) 活性が上昇したことから、AKIP1が骨分化抑制に寄与する可能性を見出した。一方、akip1非ノックダウン条件では、外来性Ptc1 ICD7の導入がALP活性に影響を与えないのに対し、akip1ノックダウン条件下では外来性Ptc1 ICD7導入がALP活性を大きく減少させた。これらの結果は、AKIP1発現抑制に起因したALPの活性化がPtc1 ICD7による抑制を受け得ることを示唆する。さらに、AKIP1によるPtc1 ICD7の核局在への制御機構を調べるために、間葉系幹細胞におけるPtc1 ICD7 C末端認識抗体を用いた免疫染色により、ICD7の細胞内局在を解析した。コントロールであるakip1非ノックダウン条件では、Ptc1 ICD7が強く核に局在するのに対し、akip1ノックダウン条件では、細胞内在性Ptc1 ICD7シグナルが核から失われることを見出した。これらの結果から、Ptc1 ICD7の核局在にはAKIP1が必要であることが示唆された。

到目前为止，我已经确定了一种新型结合蛋白（AKIP1）与人patched1（PTC1）的第7个细胞质结构域（ICD7）的新型结合蛋白。有报道称AKIP1参与了NF-κB家族转录因子P65的核保留率。另一方面，根本没有研究Sonic刺猬（SHH）-PTC1依赖性信号通路和AKIP1之间的关联。因此，在这项研究中，我们着重于与AKIP1形成与AKIP1的PTC1 ICD7复合物形成的复合物，以阐明AKIP1控制PTC1 ICD7的机理。挑战是通过测量GLI转录因子的活性，即SHH信号通路中的最终输出，确定PTC1 ICD7-AKIP1复合物的作用。在具有SHH响应能力的间充质干细胞中，在siRNA敲低AKIP1基因的条件下，与对照组相比，碱性磷酸酶（ALP）的活性是成骨细胞分化标记的活性，因此与对照组相比增加了，因此AKIP1可能有助于抑制骨骼分化。另一方面，在AKIP1-NON-KNOCKDOWN条件下，外源性PTC1 ICD7的引入不会影响ALP的活性，而在AKIP1-KNOCKDOWN条件下，外源性PTC1 ICD7引入了显着降低ALP活性。这些结果表明，由于PTC1 ICD7，由于AKIP1表达的抑制而引起的ALP激活。此外，为了研究AKIP1对PTC1 ICD7调节的机理，通过使用PTC1 ICD7 C端识别抗体在间质干细胞中进行免疫染色来分析ICD7的亚细胞定位。我们发现，在对照AKIP1非敲低条件下，PTC1 ICD7强烈定位于核，而在AKIP1敲低条件下，内源性PTC1 ICD7信号从细胞核中丢失。这些结果表明，PTC1 ICD7的核定位需要AKIP1。