概日リズムの多重リン酸化を校正する酵素機能解析

本研究は概日時計の周期を決定しているCKIδの脱リン酸化活性に着目し、多段階なリン酸化が1日24時間の正確性を示す分子メカニズムの解明を目的としている。時計タンパク質由来のペプチドライブラリーからCKIδの脱リン酸化基質をセレクション可能な評価系を構築し、脱リン酸化活性を促進させるペプチドを発見した。さらにCKIδの脱リン酸化活性部位を結晶構造を基にリン酸化認識部位を推測して、点変異体を導入して、CKIδの脱リン酸化活性部位を同定しており、CKIδの脱リン酸化機構の分子レベルでの理解は、予定通りに順調に進捗している。またCKIδの脱リン酸化機構の解明をしていく過程で、CKIδと相互作用をする時計タンパク質CRYに新たな転写活性の根底にある新しいメカニズムを見出した。CRYの転写活性は概日リズムの多段階なリン酸化に関与している可能性が示唆している。さらに転写活性を理解するためにCRYの分子動力学シミュレーションを実施して、CRYの構造変化から転写活性機構を分子レベルで明らかとした。時計タンパク質のノックアウトマウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、レスキュー系を構築した。昨年度までレスキュー効率が70％程度であったが、AAV濃度の最適化をすることでCRY1の野生型で90%まで向上させることに成功した。さらにin vitroにおいてCRY1の転写活性が弱い変異体でも本研究で構築したレスキュー系により表現型が表れている。in vitroでの活性変化とレスキュー系での表現型の相関性により、本研究で見出した新しい転写活性機構を実証した。

本研究は概日時計の周期を決定しているCKIδの脱リン酸化活性に着目し、多段階なリン酸化が1日24時間の正確性を示す分子メカニズムの解明を目的としている。時計タンパク質由来のペプチドライブラリーからCKIδの脱リン酸化基質をセレクション可能な評価系を構築し、脱リン酸化活性を促進させるペプチドを発見した。さらにCKIδの脱リン酸化活性部位を結晶構造を基にリン酸化認識部位を推測して、点変異体を導入して、CKIδの脱リン酸化活性部位を同定しており、CKIδの脱リン酸化機構の分子レベルでの理解は、予定通りに順調に進捗している。またCKIδの脱リン酸化機構の解明をしていく過程で、CKIδと相互作用をする時計タンパク質CRYに新たな転写活性の根底にある新しいメカニズムを見出した。CRYの転写活性は概日リズムの多段階なリン酸化に関与している可能性が示唆している。さらに転写活性を理解するためにCRYの分子動力学シミュレーションを実施して、CRYの構造変化から転写活性機構を分子レベルで明らかとした。時計タンパク質のノックアウトマウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、レスキュー系を構築した。昨年度までレスキュー効率が70％程度であったが、AAV濃度の最適化をすることでCRY1の野生型で90%まで向上させることに成功した。さらにin vitroにおいてCRY1の転写活性が弱い変異体でも本研究で構築したレスキュー系により表現型が表れている。in vitroでの活性変化とレスキュー系での表現型の相関性により、本研究で見出した新しい転写活性機構を実証した。