概日リズムの多重リン酸化を校正する酵素機能解析

校准昼夜节律多重磷酸化的酶的功能分析

• 批准号: 20K15766
• 负责人: 篠原 雄太
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Hokkaido University (2021-2022)Institute of Physical and Chemical Research (2020)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K15766/
• 关键词: 概日時計; 多重リン酸化; 脱リン酸化; casein kinase 1; クリプトクロム; 温度補償性; タンパク質間相互作用; 転写活性; 蛋白質間相互作用; 校正機能; 同調機構

本研究は概日時計の周期を決定しているCKIδの脱リン酸化活性に着目し、多段階なリン酸化が1日24時間の正確性を示す分子メカニズムの解明を目的としている。時計タンパク質由来のペプチドライブラリーからCKIδの脱リン酸化基質をセレクション可能な評価系を構築し、脱リン酸化活性を促進させるペプチドを発見した。さらにCKIδの脱リン酸化活性部位を結晶構造を基にリン酸化認識部位を推測して、点変異体を導入して、CKIδの脱リン酸化活性部位を同定しており、CKIδの脱リン酸化機構の分子レベルでの理解は、予定通りに順調に進捗している。またCKIδの脱リン酸化機構の解明をしていく過程で、CKIδと相互作用をする時計タンパク質CRYに新たな転写活性の根底にある新しいメカニズムを見出した。CRYの転写活性は概日リズムの多段階なリン酸化に関与している可能性が示唆している。さらに転写活性を理解するためにCRYの分子動力学シミュレーションを実施して、CRYの構造変化から転写活性機構を分子レベルで明らかとした。時計タンパク質のノックアウトマウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、レスキュー系を構築した。昨年度までレスキュー効率が70％程度であったが、AAV濃度の最適化をすることでCRY1の野生型で90%まで向上させることに成功した。さらにin vitroにおいてCRY1の転写活性が弱い変異体でも本研究で構築したレスキュー系により表現型が表れている。in vitroでの活性変化とレスキュー系での表現型の相関性により、本研究で見出した新しい転写活性機構を実証した。

This study focused on the multi-stage determination of the periodicity of the clock and the dehydration activity of CKIδ. The correctness of the acidification of the 1 day and the 24 hours of the day is shown in the molecular analysis of the molecule. The origin of the watch's quality The クション may be used to evaluate the construction of the system and the promotion of the acidification activity of クションさせるペプチドを発见した.さらにCKIδ's acidification active siteをcrystal structureをbased acidification recognition siteをspeculationして, allotype introductionして, CKIδ's removalリン acidification active site を同定しており, CKIδ の de-リン acidification mechanism のmolecule レベルでのunderstanding は, 约定通 りに顺动に入捗している. The explanation of the acidification mechanism of CKIδ and the process of CKIδ and the interaction of CKIδ The quality of the timepiece is CRY new and active. CRY's active and multi-stage acidification and possibility of CRY are indicated.さらに転ActivityをUnderstandingするためにCRYのMolecular Dynamicsシミュレーションを実The structural modification of CRY and the active mechanism of CRY are made of molecules. Timepieces of the same quality as the watchス (AAV) ベクターを Use いて, レスキュー system を to build した. Last year's efficiency level was 70%, and the AAV concentration was optimized.をすることでCRY1のwild typeで90%までUPさせることにsuccessした. The CRY1 CRY1 CRY1 in vitro activity was weak and the heterogeneous body was weak. This study constructed the CRY1 phenotype and the expression of the CRY1 phenotype in this study. In vitro activity changes are related to phenotypes and correlations, and this study shows that new activity mechanisms are demonstrated.