超解像イメージングによるスパインシナプスの動態解析

興奮性シナプス後部構造であるスパインは、記憶・学習といった可塑的刺激に伴って変化する脳の記憶素子であると考えられている。シナプスの機能を調べるためにスパインの形態イメージングが行われるが、スパインはミクロンスケールの小さな突起でありその大きさや構造を正確に捉えることは従来の光学顕微鏡の分解能では難しい。本年度は、特にスパインの微細動態とシナプスの安定性との関わりを検証するために、特に生きた動物に適応する技術開発に取り組み、これまで確立してきた超解像イメージング技術を発展させて大きく以下の２つの基盤技術を確立した。1. in vivo 二光子顕微鏡観察を行った後で同一シナプスを固定後に超解像イメージングする手法の確立これまでの二光子-超解像相関顕微鏡観察手法では、対物レンズの収差や作動距離の問題で脳表からごく浅い領域でしか十分な分解能の顕微鏡観察が難しかった。本年度は300μm以上の厚い標本を膨張させる実験条件を最適化し、長作動距離の対物レンズと組み合わせることで、皮質2/3層の錐体細胞の頂上樹状突起から規定樹状突起までを高解像度で観察する条件を確立した。この手法とin vivo二光子顕微鏡観察を組み合わせ、生きた動物で撮影した樹状突起を膨張した組織標本中で再同定することに成功した。2. エングラム細胞のスパインシナプスを超解像イメージングする手法の確立本年度は前述した厚い標本を膨張させる技術、また前年度までに確立したエングラム細胞とその細胞形態を標識する技術を組み合わせを実施した。これにより、非エングラム細胞とエングラム細胞を同定しつつ、それぞれの細胞の100以上のスパインシナプスを定量的な解析を行った。

興奮性シナプス後部構造であるスパインは、記憶・学習といった可塑的刺激に伴って変化する脳の記憶素子であると考えられている。シナプスの機能を調べるためにスパインの形態イメージングが行われるが、スパインはミクロンスケールの小さな突起でありその大きさや構造を正確に捉えることは従来の光学顕微鏡の分解能では難しい。本年度は、特にスパインの微細動態とシナプスの安定性との関わりを検証するために、特に生きた動物に適応する技術開発に取り組み、これまで確立してきた超解像イメージング技術を発展させて大きく以下の２つの基盤技術を確立した。1. in vivo 二光子顕微鏡観察を行った後で同一シナプスを固定後に超解像イメージングする手法の確立これまでの二光子-超解像相関顕微鏡観察手法では、対物レンズの収差や作動距離の問題で脳表からごく浅い領域でしか十分な分解能の顕微鏡観察が難しかった。本年度は300μm以上の厚い標本を膨張させる実験条件を最適化し、長作動距離の対物レンズと組み合わせることで、皮質2/3層の錐体細胞の頂上樹状突起から規定樹状突起までを高解像度で観察する条件を確立した。この手法とin vivo二光子顕微鏡観察を組み合わせ、生きた動物で撮影した樹状突起を膨張した組織標本中で再同定することに成功した。2. エングラム細胞のスパインシナプスを超解像イメージングする手法の確立本年度は前述した厚い標本を膨張させる技術、また前年度までに確立したエングラム細胞とその細胞形態を標識する技術を組み合わせを実施した。これにより、非エングラム細胞とエングラム細胞を同定しつつ、それぞれの細胞の100以上のスパインシナプスを定量的な解析を行った。