プロテオミクスで探るCEP290変異が関与する繊毛病の病態メカニズム

利用蛋白质组学探索涉及 CEP290 突变的纤毛病的病理机制

• 批准号: 20K16157
• 负责人: 橋本 寛
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K16157/
• 关键词: 繊毛病; オルガノイド; プロテオミクス; iPS

一次繊毛は細胞内においてアンテナ様構造をした細胞内小器官であり、その機能の破綻はシグナル伝達の不全などに伴い、生体においては脳の変性、嚢胞腎、肥満など様々な症状をきたす。CEP290は一次繊毛のTransition zoneに局在するタンパク質であり、その変異はやはり小脳や脳幹の萎縮、網膜色素変性や、嚢胞腎など全身性に多様な表現型を示す繊毛病発症の原因として知られている。iPS細胞におけるノックアウト細胞の樹立を目的として、CEP290を始めとする一次繊毛のTransition zoneに局在する遺伝子に対して、CRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトを行った。前回までに、CEP290遺伝子において、HeterogenousなノックアウトiPSしか樹立できていなかったが、ガイドRNAの位置を変え、エレクトロポレーションによるCRISPR-Cas9の導入と、導入された細胞のFACSによるセルソートを行った。これによりCEP290を始めとするTransition zoneに局在する遺伝子のHomogenousなノックアウトに成功した。加えて、同一遺伝子に対して複数のノックアウトクローンの樹立ができた。ノックアウトクローンはサンガーシークエンスとイムノブロッティングにより確認を行った。次に、これらノックアウトされた遺伝子のiPS細胞を用いてオルガノイドの作成を行った。その結果、野生型iPS細胞とCEP290ノックアウトiPS細胞から誘導したオルガノイドの作成に成功した。今後は、免疫染色による表現系の違いの確認と、このオルガノイドを用いてRNA-seqを行うことで、機能に寄与する変化があるかどうかを網羅的に解析する予定である。

In one time, the small organs in the cells were damaged, the small organs were damaged, and the symptoms were affected in one time. In the first time, the CEP290 Transition zone bureau showed that the cause of the disease was not known because of the disease, such as atrophy, retinitis pigmentosa, and cytopathic syndrome. IPS