インフルエンザ感染肺傷害に対する誘導肺上皮様細胞の有効性の検討

检查诱导肺上皮样细胞对抗流感感染肺损伤的有效性

• 批准号: 20K17191
• 负责人: 森田 篤帆
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17191/
• 关键词: 肺上皮様細胞; iPUL細胞; 直接リプログラミング; オルガノイド; インフルエンザ; ARDS

本研究の目的は、直接リプログラミング法でマウス胎児線維芽細胞（MEF）から誘導した肺上皮様細胞（induced pulmonary epithelial-like cells;iPUL細胞）をオルガノイド培養後にマウス生体内へ投与し、in vivoでの有効性やその機序を検証することである。生体内投与の際には非肺上皮様細胞の混在を最小限にするために、フローサイトメトリー等で可能な限りiPUL細胞の純度を高める必要がある。また、iPUL細胞がマウス個体の肺胞領域に生着したか否かの確認は生体内動態を解明する上で重要であることから、それらを両立させる手法の確立を試みた。CAG-EGFPマウス（グリーンマウス）のMEFから作成したiPUL細胞は、純化の段階ではGFPを利用できないが、生体内投与後はサイレンシングや分化の影響を受けずに追跡できるため有用である。そして、マウス成獣肺のII型肺胞上皮細胞（AT2）は、EpCAM+MHCII+やEpCAM+LysoTracker+といった表面抗原の組み合わせで高純度で単離できることが報告されているため、iPUL細胞にも適用可能か検討した。その結果、iPUL細胞には一定の割合でMHCII発現が認められたものの、成熟iPUL細胞に特異的ではなかった。また、EpCAM+LysoTracker+の集団に関しても高純度なiPUL細胞ではなかった。そのため、グリーンマウスのMEFから作成してEpCAM+Thy1.2-等の条件で上皮系細胞を単離した後、AT2のオルガノイド培養条件下で継代し徐々に純度を上げたり、SPC-GFPマウスのMEFから作成したiPUL細胞にレンチウイルスベクターを用いて蛍光タンパク質を安定発現させ、追跡可能にしたりすることを目指している。疾患モデルとしては、感染モデルの他にもブレオマイシン肺傷害モデルでの評価系確立を進めている。

The aim of this study was to demonstrate the mechanism of embryonic fibroblast (MEF) proliferation from induced pulmonary epithelial-like cells (iPUL) to cultured MEF in vivo and in vivo. In vivo, the minimum concentration of non-lung epithelial cells may be limited by the high purity of iPUL cells. To determine the importance of understanding the dynamics in vivo of the lung cells of the human body CAG-EGFP MEF is made from IPUL cells and purified at different stages. GFP is used in the differentiation of IPUL cells after in vivo injection. In addition, it is possible to use EpCAM+MHCII+ EpCAM+LysoTracker+ to synthesize high purity human lung type II epithelial cells (AT2). As a result, iPUL cells have certain cleavage and MHCII detection, and mature iPUL cells have specific cleavage. EpCAM+LysoTracker+ is a collection of high-purity iPUL cells. The MEF of SPC-GFP was prepared under the conditions of EpCAM+Thy1.2-and so on. After isolation of epithelial cells, AT2 cells were cultured under the conditions of high purity. SPC-GFP MEF was prepared into iPUL cells. Disease, infection, other diseases, lung injury, disease evaluation system established