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難治性肺疾患への臨床応用を見据えた誘導肺上皮様細胞の生体内動態解明

阐明诱导肺上皮样细胞的体内动力学，以期临床应用于难治性肺部疾病

基本信息

批准号：
22KJ2672
负责人：
森田篤帆
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

まず、SPC/GFPリポーターマウスの胚性線維芽細胞に直接リプログラミング法を用いて特異的4因子を導入後にオルガノイド培養を行い、SPC（GFP）陽性、EpCAM陽性、Thy1.2陰性のiPUL細胞を作成した。分化転換する細胞の割合は全体の5%程度であったが、未純化な細胞群からiPUL細胞のみをFACSでソートすることで純化し、継代を重ねることで拡大培養に成功した。核型解析や腫瘍形成試験では癌化を示唆する所見は認めなかった。電子顕微鏡で観察すると、iPUL細胞はAT2細胞に類似した形態を持っており、特異的とされるラメラ体の存在も確認できた。qRT-PCRではSftpcやSftpbといったAT2細胞関連遺伝子が高発現していたのに対し、AT1細胞、Club細胞、基底細胞、繊毛細胞、線維芽細胞などの関連遺伝子発現は全体的に低く、AT2への指向性が最も高いと考えられた。この傾向は免疫染色でも同様であり、継代を繰り返しても誘導前の線維芽細胞に逆戻りしないことを確かめた。RNA sequenceを行うと、PCAプロットでiPUL細胞はオルガノイド培養を行ったAT2細胞と近い位置にプロットされ、トランスクリプトームが類似していることが判明した。蛍光色素でiPUL細胞を標識し、ブレオマイシン肺傷害モデルマウスへ投与すると、移植後100日の時点でも肺胞領域に生着していることが組織免疫染色によって確認できた。生着した細胞は形態的には明確にAT1へと分化したことは確認できなかったものの、AT1マーカーを発現する細胞の割合は増加しており、分化移行状態にあることも示唆された。FACS解析では、レシピエント肺上皮の全細胞数のうち約0.5%が移植したiPUL細胞であった。再回収したiPUL細胞は再度in vitroで培養・継代可能であったことから、生体内でも長期にわたり細胞死しないことが立証できた。

In the process of culture, SPC (GFP)-positive, EpCAM-positive and Thy1.2-negative iPUL cells were produced by introducing four specific factors into the embryonic line cell culture system. 5% of the differentiated cells were isolated and cultured successfully. Karyotype analysis and tumor formation tests were performed to detect the presence of cancer. Microscopic examination of the AT2-like morphology of iPUL cells confirmed the presence of specific cells. qRT-PCR showed that Sftpc, Sftpb and AT2 cells had high expression of related genes, AT1 cells, Club cells, basal cells, hair cells, and linear bud cells had low expression of related genes, and AT2 cells had the highest expression of related genes. This tendency is to reverse the process of immunostaining before induction. RNA sequence analysis showed that IPUL cells were similar to AT2 cells when cultured in vitro. The cells were identified by fluorescent dye and confirmed by tissue immunostaining at 100 days after transplantation. The cell morphology was clearly identified as AT1, and the cell differentiation was identified as AT1. FACS analysis showed that the total cell count of lung epithelium was about 0.5% and that of transplanted iPUL cells was about 0.5% In vitro culture, the cells were cultured for a long time.