難治性肺疾患への臨床応用を見据えた誘導肺上皮様細胞の生体内動態解明

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まず、SPC/GFPリポーターマウスの胚性線維芽細胞に直接リプログラミング法を用いて特異的4因子を導入後にオルガノイド培養を行い、SPC（GFP）陽性、EpCAM陽性、Thy1.2陰性のiPUL細胞を作成した。分化転換する細胞の割合は全体の5%程度であったが、未純化な細胞群からiPUL細胞のみをFACSでソートすることで純化し、継代を重ねることで拡大培養に成功した。核型解析や腫瘍形成試験では癌化を示唆する所見は認めなかった。電子顕微鏡で観察すると、iPUL細胞はAT2細胞に類似した形態を持っており、特異的とされるラメラ体の存在も確認できた。qRT-PCRではSftpcやSftpbといったAT2細胞関連遺伝子が高発現していたのに対し、AT1細胞、Club細胞、基底細胞、繊毛細胞、線維芽細胞などの関連遺伝子発現は全体的に低く、AT2への指向性が最も高いと考えられた。この傾向は免疫染色でも同様であり、継代を繰り返しても誘導前の線維芽細胞に逆戻りしないことを確かめた。RNA sequenceを行うと、PCAプロットでiPUL細胞はオルガノイド培養を行ったAT2細胞と近い位置にプロットされ、トランスクリプトームが類似していることが判明した。蛍光色素でiPUL細胞を標識し、ブレオマイシン肺傷害モデルマウスへ投与すると、移植後100日の時点でも肺胞領域に生着していることが組織免疫染色によって確認できた。生着した細胞は形態的には明確にAT1へと分化したことは確認できなかったものの、AT1マーカーを発現する細胞の割合は増加しており、分化移行状態にあることも示唆された。FACS解析では、レシピエント肺上皮の全細胞数のうち約0.5%が移植したiPUL細胞であった。再回収したiPUL細胞は再度in vitroで培養・継代可能であったことから、生体内でも長期にわたり細胞死しないことが立証できた。