皮膚バリア機能の維持・向上に対する遊離D-アミノ酸の役割

点击翻译按钮获取中文摘要

昨年度までHaCaTを用いて細胞分化の検討を行っていたが、薬液処置なしでも分化マーカーであるケラチン10が発現しており、ポジティブコントロールとなるLPAやラクトフェリンを加えても分化の促進は認められなかった。そこで本年度は、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）へ細胞種を変更して再検討した。NHEKに対して1mMカルシウムを添加すると、分化が促進されることが確認された。この細胞をショットガンプロテオミクスに供するため、ビーズ破砕によるタンパク質抽出を行ったが、分化細胞では細胞が凝集し、長時間ビーズ破砕に供しても細胞が溶解しなかった。そこで、細胞の可溶化条件を検討し、質量分析装置にそのまま注入可能なn-ドデシル-β-D-マルトシドや沈殿により除去可能な相間移動溶解剤を用いることで可溶化が進むことが分かった。また、遊離D-アミノ酸を解析するため、二次元高速液体クロマトグラフィーシステムの構築を行った。1次元目分離においてアミノ酸を分離し、2次元目分離においてL体とD体を分離するが、最終的な検出器を質量分析とするために、移動相条件やカラムを検討した。さらに、タンパク質の質的変化を調査するための技術開発を行った。リン酸化や酸化といった一般的な翻訳後修飾は質量変化を伴うため、質量分析により解析が可能である。一方で、アミノ酸の異性化は分子量変化を伴わないため、質量分析による網羅的な解析は難しかった。本年度は、タンパク質中のアスパラギン酸異性化を高感度かつ網羅的に解析する手法を合わせて開発した。