腸管上皮バリア機能におけるPDZRN3を介した新たな制御機構の解明

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腸管上皮細胞層におけるバリア機能の破綻は食物アレルギーなどの様々な有害事象を引き起こす。本研究では、バリア機能の要であるタイトジャンクション(TJ)の制御におけるPDZRN3の役割を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、ヒト結腸腺癌由来細胞株Caco-2の単層形成モデルにおけるバリア機能の評価系を構築し、バリアの形成とPDZRN3の発現量が逆相関を示すことを見出した。また、単層形成過程ではバリアの主要な構成因子であるクローディン1の発現が誘導されるが、PDZRN3を過剰発現させると、クローディン1の発現量増加が抑制され、細胞間隙の密着性、（経上皮電気抵抗値）が減少することを明らかとし、PDZRN3はTJの形成を負に制御している可能性を見出してきた。本年度は、TJ形成におけるPDZRN3の抑制作用がどのような機序で発現するのかを中心に解析を試みた。PDZRN3は標的蛋白質をユビキチン化し、プロテアソームで分解させる機能を持つE3ユビキチンリガーゼに属する。また、標的蛋白質のトラップに必要な蛋白質相互作用ドメインとして、PDZドメインを二つ持ち、さらにPDZ結合モチーフをC末端に有する。そのリガーゼ活性に重要なRINGドメインを欠損した変異体をはじめ、二つのPDZドメイン各々の欠損体あるいは両方の欠損体、PDZ結合モチーフ欠損体の強制発現系を準備した。単層形成開始時にそれらを強制発現させて各種の評価を行ったところ、クローディン1の発現量およびTEER値に変化が見られておらず、現在、その発現量の調整や、発現させる時期などを詳細に検討している。PDZRN3はマルチドメイン蛋白質であり、PDZ関連構造以外にもZnフィンガードメインなど、機能的な構造を複数有するため、それらの構造要因がクローディン1発現やバリア機能の制御に関わっている可能性も考慮して、次年度の解析につなげていく。